セレンの特異的な反応性を利用したユビキチン化糖タンパク質プローブの新規合成法

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H02211
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 和泉 雅之 高知大学, 教育研究部総合科学系複合領域科学部門, 教授 (80332641)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 精密化学合成 / 糖タンパク質 / ユビキチン / セレン

Outline of Annual Research Achievements

本研究課題では、遺伝子の変異やストレスなどにより変性した糖タンパク質のユビキチンープロテアソーム系による分解機構を明らかにするためのプローブとして、ユビキチンの付加位置や数、糖鎖の構造、タンパク質部分の立体構造が異なる数種類のユビキチン化糖タンパク質を合成する。昨年度は、本研究課題の鍵反応となるタンパク質の新規ユビキチン化反応であるセレノイソペプチドケミカルライゲーション (SeICL) 法の開発をおこない、予想通りリジン側鎖アミノ基へのライゲーション反応が進行すること、システイン残基側鎖のチオール基を損なうことなく脱セレノ化が進行することを見出した。今年度は、このSeICL法を用いてターゲットの糖タンパク質合成を目指す基礎段階として、SeICL法に不可欠なδ-セレノ-L-リジン誘導体の大量供給を可能とするために合成ルートの最適化をおこなった。そのなかで収率の低下につながる副反応を見出し、合成ルートを改善することができた。また、この合成ルートでは酵素による光学分割でδ-セレノ-L-リジン誘導体を得ていたが、今後ラセミタンパク質結晶化法を利用したユビキチン化糖タンパク質の立体構造解析に有用となるδ-セレノ-D-リジン誘導体も酵素をもちいた光学分割で合成できることを見出した。これらの研究成果は、国際糖質学会と日本化学会春季年会で発表した。また、糖タンパク質合成に必要な糖鎖の卵黄からの精製および糖タンパク質部分のペプチドセグメントの合成も進めた。今後は、δ-セレノ-L-リジンを含む糖タンパク質の合成とユビキチン化反応を検討し、実際のユビキチン化糖タンパク質プローブの合成を達成する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

申請者は、本研究課題の開始とともに高知大学理工学部に異動し研究室の立ち上げと実験環境の整備をおこなってきた。本年度は２年目となり、最初の卒研生２名が本研究課題に参画して研究を行ってくれた。本研究の標的化合物であるユビキチン化糖タンパク質プローブの合成を達成するには、原料であるδ-セレノ-L-リジン誘導体と糖鎖を十分量供給しておくことは不可欠である。δ-セレノ-L-リジン誘導体は１２工程の合成ルートであり各工程の問題点を洗い出して最適化をおこなうのに予想より時間を要した。また、卵黄からの糖鎖の単離は種々のクロマトグラフィーを駆使する難易度が高く時間もかかり熟練を必要とする工程である。そのため、本研究の鍵反応となるSeICL法の進行は確認できたのもの、現在の進捗状況としては、δ-セレノ-L-リジン誘導体と糖鎖という原料供給体制の確立とユビキチンおよび糖タンパク質のペプチドセグメントの一部の合成までの段階であるためやや遅れているとした。しかし、本研究に関わっている原料合成の技術を習得した２名の学生が修士課程に進学し、今後２年間そのまま本研究課題を進めてくれるため、来年度以降で遅れは十分取り戻せると考えている。

Strategy for Future Research Activity

本年度までの研究で、本研究の鍵反応となるSeICL法が予想通り進行することを確認し、本研究に不可欠な原料であるδ-セレノ-L-リジン誘導体と糖鎖の供給ルートをほぼ確立することができた。また、これらの原料供給の技術を持って研究に参画する修士課程学生が２名いる体制となった。今後はこれらの原料を利用してユビキチン化糖タンパク質プローブの合成を進めていくわけであるが、研究を遂行する上ですこし弱い点としてユビキチンや糖タンパク質の合成に必要なペプチドセグメントの合成があげられる。そこで、本年度は新たに卒研生１名にペプチド合成を担当してもらい３名体制で研究を遂行することとする。また、昨年度購入したHPLCにフラクションコレクターを追加することで、ペプチド合成でもっとも時間のかかるHPLCを用いた精製段階を効率化し、少人数でも本研究課題を進めることができるように実験環境の整備もすすめる。このように、研究体制と実験環境を整えることで本研究課題の達成に向けてスピードアップしていく予定である。

Research Products

• [Presentation] ペプチド固相合成に利用できる δ 位に置換基を有する D リジン誘 導体の合成 (2019)
  • Author(s): 秋山 龍成、田中 勇祐、岡本 亮、梶原 康宏、和泉 雅之
  • Organizer: 日本化学会第９９春季年会
• [Presentation] Selenoisopeptide Chemical Ligation toward Chemical Synthesis of Homogeneous Ubiquitinated Glycoprotein Containing Disufide Bond (2018)
  • Author(s): Izumi, M., Tanaka, Y., Araki, H., Maki, Y., Okamoto, R., Kajihara, Y.
  • Organizer: 29th International Carbohydrate Symposium
  • Int'l Joint Research