2017 Fiscal Year Annual Research Report
Comprehensive understanding of the phospholipid flip mechanism in the endoplasmic reticulum and establishment of the control technology of biomembrane dynamics
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17H02941
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
中野 実 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 教授 (70314226)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
池田 恵介 富山大学, 大学院医学薬学研究部(薬学), 准教授 (00553281)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | リン脂質 / フリップフロップ / 蛍光 / 中性子散乱 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アラニン・ロイシンの繰り返し配列に極性アミノ酸を1残基導入した膜貫通モデルペプチドを作成し、ベシクルに組み込んだペプチドのリン脂質スクランブラーゼ活性を蛍光消光法により評価した。スクランブラーゼ活性はペプチドに導入した極性アミノ酸残基の種類に依存し、残基の親水性度とスクランブラーゼ活性との間に高い相関が見られた。また、膜貫通領域の長さにも依存し、膜貫通領域が17アミノ酸のペプチドは高い活性をもち、21アミノ酸、および25アミノ酸のペプチドは活性を示さなかった。一方、19アミノ酸のペプチドは高いスクランブラーゼ活性とベシクル内封物質の漏出活性を示した。後者ペプチドの高い膜不安定化特性について、MDシミュレーションを用いてその原因を特定した。
HEK293細胞の小胞体画分を用いたスクランブラーゼ活性の評価について、条件検討を行い、活性評価ができることを確認した。小胞体スクランブラーゼの候補タンパク質として以前に見いだしたEDEM1について、現在ノックダウン実験を実施している。
ホスホリパーゼＤ(PLD)を用いたホスファチジル基転移反応によって、ベシクルの二重層の外側（外葉）のホスファチジルコリン(PC)をホスファチジルセリン(PS)やホスファチジルエタノールアミン(PE)に変換し、エンドソームなどの細胞内小胞（PSやPEを細胞質側（外側）に有する膜）と同様の非対称性構造をもつベシクルを高効率、高収量で得る手法を確立した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
モデル膜系を用いた実験では、ペプチド配列とスクランブラーゼ活性との関係について、多くの知見が得られた。また、MDシミュレーションと組み合わせることで、メカニズムを分子レベルで議論できるようになった。非対称ベシクル作製法の確立によって、研究手法の幅が広がった。一方、細胞実験ではノックダウン効率が低いため、条件検討を進める必要があるものの、活性評価法はほぼ構築できている。以上のことから、本研究課題は概ね順調に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の予定通り研究を進める。モデル膜系の実験では中性子散乱法を導入してスクランブラーゼ活性評価を試みる。また、より複雑な配列をもつペプチドを用いた検討を始める予定である。細胞実験ではスクランブラーゼ候補タンパク質のノックダウン実験を進め、小胞体膜のリン脂質フリップフロップ機構の解明を目指す。
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