2017 Fiscal Year Annual Research Report
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17H03085
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| Research Institution | Japan Advanced Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
藤本 健造 北陸先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 教授 (90293894)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
坂本 隆 和歌山大学, システム工学部, 准教授 (80423078)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 光架橋反応 / アンチジーン法 / ゲノムDNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ゲノムDNAを対象とした化学的・酵素的操作法は遺伝子増幅、メチル化DNA解析、ゲノム編集などに応用されている。研究者はこれまでの研究において光応答性人工核酸である3-シアノビニルカルバゾール(CNVK)を見出し、CNVKを含むオリゴDNAが相補鎖的1本鎖DNAもしくはRNAと数秒の光照射により光架橋することを報告していた。しかし、これまでは２本鎖DNAに対してCNVKを含むオリゴDNAの侵入が難しいため、ゲノムDNAの光操作は困難であった。そこで、平成29年度の実績として、まずゲノムDNAの光操作に必要と考えられるダブルストランドインベーションDNAの構築を行った。CNVKとシアノウリジン（CNU）を含む２本のオリゴDNAを用いることで、２本鎖DNAに対してダブルストランドインベーションDNAを構築できることを見出した。CNUプローブを導入することにより、2種類のオリゴDNA同士の自己架橋が抑制され、二本鎖DNAに対して光架橋しているものと考えられる。また、平成29年度には可視光域で操作可能な新規光架橋素子としてピラノカルバゾールヌクレオシドの開発に成功した。400 nmの光照射を10秒行なうことにより対象となるオリゴDNAと光架橋することを見出した。架橋体のNMR構造解析の結果、CNVKと同様に[2+2]光環化反応により標的ピリミジン塩基と光架橋していることを見出した。ピラノカルバゾールヌクレオシドを用いることで、細胞毒性の弱い光波長で光架橋反応を誘起することが可能となった。その他、チミンダイマーの光修復を可能とする新規光増感剤の開発や反応性の異なる光架橋素子を用いることによりメチルシトシンを定量的に検出可能であることを実証した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は細胞内でのゲノム操作に向け、新規光架橋素子の合成、およびその評価を行った。その結果、従来の紫外光よりも細胞への光毒性の低い可視光で操作可能な新規光架橋素子の開発に成功した。400 nmで数秒、450 nmでも数分の光照射で標的核酸と光架橋することを見出した。また、シアノビニルカルバゾール（CNVK）とシアノウリジン（CNU）を含む２本のオリゴDNAを用いることで、ゲノム操作に必要と考えられる２本鎖DNAに対してダブルストランドインベーションDNAを構築できることを見出した。以上のことから計画はおおむね順調に進行していると考えている
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度合成に成功した光架橋ODNプローブが狙い通りの位置に光架橋しているか否かを、シークエンスゲル電気泳動により評価する。具体的には、5'末端をビオチン標識したプライマーを用いたeGFPゲノムDNAに対する鎖伸長反応を行う。pDDIによりpDDI-dsODNが光架橋した部位で鎖伸長反応が停止することから、生成DNAの鎖長を調べることで光反応部位を特定することができる。変性PAGE後、メンブレンへの転写、アビジン-HPRを用いたケミルミネセンスにより生成DNAのPAGEイメージを取得する。ddNTPを用いて伸長反応を行ったラダーサンプルとの比較から、光反応部位を特定する。これにゲノムDNA上の狙った位置に正確に反応することを証明する。またフォスフォロチオエイト化したDNAを合成し、細胞内での光架橋反応の検証を行う。二本鎖DNAに対する光架橋の足場となる1本鎖領域、プローブ同士が二本鎖を形成する２本鎖領域、光架橋素子の位置を最適化することにより、二本鎖DNAに対する光架橋率の向上を検討する。
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