2019 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of effective consecutive chemical reaction in cell with formation of supramolecular enzyme complex
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17H03092
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
當舎 武彦 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 専任研究員 (00548993)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
新井 博之 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (70291052)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 一酸化窒素 / 脱窒 / 超分子複合体 / CryoEM / 金属酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内において、硝酸から窒素分子への4段階の連続した還元反応である脱窒のような連続化学反応がどのように効率よく制御されているのか理解するために、脱窒に関わるタンパク質群が超分子複合体を形成し協調的に機能しているという概念に基づき、研究を進めている。
脱窒タンパク質の超分子複合体を単離するために、脱窒条件で培養した緑膿菌からの精製を試みた。界面活性剤の種類をふって細胞膜から脱窒タンパク質の可溶化を試みた。可溶化後の試料についてショ糖密度勾配法により分離を行ったところ、用いる界面活性剤の種類により、移動度の異なる画分が得られた。得られた画分は、緑がかった茶色を示したことから、脱窒酵素を含む画分が得られているものと考えている。今後は、スケールアップを行い単離された成分の分析を進める。
前年度より、低温電子顕微鏡（CryoEM）法による構造解析に取り組みはじめ、複合体ではないものの脱窒タンパク質の一つでありNOの分解を行うキノール依存性一酸化窒素還元酵素（qNOR）についてCryoEMによる構造決定に成功している。得られた知見は、脱窒におけるNOの迅速な分解機構の理解につながるだけでなく、今後の脱窒タンパク質複合体の構造解析の一助になる。
脱窒におけるNOの分解機構に関する理解を深めるために、一酸化窒素還元酵素（NOR）によるNO分解の分子機構を時間分解分光計測により調べてる。その結果、NORによるNO分解では、段階的なNO結合により、酵素反応が巧妙に制御されていることがわかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
脱窒タンパク質群による超分子複合体の単離精製を目指して、脱窒菌の細胞膜の可溶化法を検討してきた。脱窒酵素の可溶化を種々の界面活性剤を用いて行い、可溶性画分をショ糖密度勾配法により分析したところ、界面活性剤の種類により移動度の異なる成分、すなわち見かけ上の分子量が異なる画分が得られた。このような画分は、ヘムを含む脱窒酵素であるNORを含んでいると考えられる可視領域の吸収をもっており、その詳細な分析を進めることで、複合体の単離が可能性が期待できる。
脱窒タンパク質複合体のCryoEMによる構造解析には、更なる試料調製の検討が必要であるが、昨年度、脱窒において中心的な役割を担うキノール依存性NOR（qNOR）の構造をCryoEM法によって決定することができた。この知見を基に、髄膜炎菌のqNORについてもCryoEMによる構造解析を試み、3.1 Å分解能での構造解析に成功した。前年度に構造を決定したものと同様に髄膜炎菌のqNORも二量体を形成しており、二量化が酵素活性に必須であることを突き止めた。qNORの構造解析を通じて得た知見は、脱窒タンパク質複合体のCryoEMを用いた構造解析にもいかされるであろう。
脱窒における迅速なNO分解の反応機構の詳細を理解するために、NORによるNO還元の分子機構を調べた。光解離性の基質を利用した時間分解計測により、NO分子が段階的にNORに結合することで、NO還元が進行することを発見した。また、反応に必要となるプロトン輸送に関わるアミノ酸残基に変異を加え、プロトン輸送を抑制したNOR変異体で同様に実験を行い、プロトン輸送のタイミングを明らかにすることができた。今後は、時間分解振動分光を用いるなど、より詳細な反応機構解明を目指す。
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| Strategy for Future Research Activity |
脱窒タンパク質複合体を緑膿菌より直接単離する方法の確立を目指す。これまでの実験で種々の方法を試してきたが、界面活性剤の種類や濃度が可溶化に与える影響が大きいので、様々な界面活性剤を用いた可溶化を行う。可溶化後は、ショ糖密度勾配により可溶化した画分の分析を行い脱窒タンパク質複合体の単離を試みる。同時にこれまでにも検討してきた脱窒タンパク質を精製し、それらを混合することにより複合体を形成させることも継続して行う。そのために、亜硝酸/硝酸交換輸送体の発現系を構築する。複合体の試料が得られれば、電子顕微鏡を用いた構造解析に取り組む。構造決定後は、相互作用部位など脱窒タンパク質複合体の機能に重要であると推測されるアミノ酸残基の変異体を調製し、機能解析を行うことで、複合体形成の機能的意義の理解を目指す。
本課題を通じて、明らかにしたqNORの構造解析についても、qNORの構造機能相関の更なる理解のために研究を進める。これまでの研究から、NO還元に必要となる電子やプロトンの輸送に関わるアミノ酸の情報が得られているので、それらの変異体の構造解析を行う。また、qNORの機能を異なる様式で阻害する化合物が複数判明してるので、それらとの複合体の構造解析を進めることで、qNORの機能の理解がより進むものと期待できる。
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