2017 Fiscal Year Annual Research Report
Structure and function of transition metal ions-containing sensor proteins
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17H03093
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| Research Institution | Center for Novel Science Initatives, National Institutes of Natural Sciences |
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Principal Investigator |
青野 重利 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター), 生命創成探究センター, 教授 (60183729)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 光センサータンパク質 / アデノシルコバラミン / 転写調節因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヘム（鉄ポルフィリン錯体）、およびビタミンB12（コバラミン錯体）は、代表的な遷移金属含有型補欠分子族であり、タンパク質中に存在するこれらの分子が活性中心として機能することにより、多様な生理機能を発現することはよく知られている。本研究では、ビタミンB12（コバラミン）をセンサー活性中心として利用している、新規な光センサー型転写調節因子CarHを研究対象とし、CarHによるセンシングの分子機構解明を目的とした研究を行った。
Thermus thermophilusに含まれるCarHは、カロテノイド色素合成酵素の発現を光依存的に制御している転写調節因子であり、アデノシルコバラミンを光センサーとして利用していると考えられているが、その構造や機能については不明な点が多く残されている。本研究において、暗所で調製したアデノシルコバラミン結合型CarH（AdoCbl-CarH）は、四量体構造を有しているが、これに可視光を照射すると単量体へと解離することを明らかにした。光照射による四量体から単量体への高次構造変化は不可逆的な変化であり、光照後のサンプルを暗所に戻しても四量体へと戻ることはなかった。CarHによるDNA結合反応の予備的な検討実験の結果、四量体構造を有しているAdoCbl-CarH がDNA結合能を有している一方で、単量体構造のCarHはDNA結合能を示さないことが分かった。CarHによる光センシング、および光によるCarHの機能制御の分子機構を明らかにするためには、光感知前後でのCarHの構造情報が必要不可欠である。そこで、CarHの結晶構造解析のため、結晶化スクリーニングを行い、いくつかの条件で結晶を得ることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新規な光センサータンパク質CarHの発現系構築を行い、結晶化実験および機能解析のために必要な量の組換え型CarHが得られる発現系の構築に成功した。発現した組換え型CarHの精製方法の検討を行い、結晶化実験に使用可能な純度の試料が得られる精製条件を確立することができた。精製した試料を用いて結晶化スクリーニングを行ったところ、当初の結晶化スクリーニングにおいては、凝集状態を容易に形成してしまい、構造解析に適した結晶ができないことが判明した。
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| Strategy for Future Research Activity |
試料の凝集を回避し、回折データが取得可能な単結晶が得られる条件を見つけるため、広範な結晶化条件下における結晶化スクリーニングを継続して実施する。現在、単結晶を得るには至っていないものの、凝集状態を形成しない結晶化条件については、いくつかの候補条件を見出しており、これらの条件を中心にさらに結晶化条件の精密化を行うことで、CarH単結晶を得ることを試みる。
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