2018 Fiscal Year Annual Research Report
Simultaneous production of monoclonal antibodies against multiple membrane proteins and their evaluations for the applications to therapeutic medicines
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17H03468
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
冨田 昌弘 三重大学, 工学研究科, 教授 (20183494)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中野 秀雄 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (00237348)
安川 智之 兵庫県立大学, 物質理学研究科, 教授 (40361167)
湊元 幹太 三重大学, 工学研究科, 准教授 (80362359)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 立体構造認識モノクローナル抗体 / 誘電泳動 / 無細胞発現系 / プロテオリポソーム / 分子標的治療薬 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１．DNA免疫法およびSST（立体構造特異的ターゲティング）法を用いて、標的タンパク質GPCR（Gタンパク質共役受容体）であるβ2AR、CRHR1に対する立体構造特異的モノクローナル抗体を作製することができた。抗CRHR1抗体については、Cell-ELISA法に加えて、免疫蛍光染色法およびウェスタンブロッティング法に基づきモノクローナル抗体の立体構造認識を明らかにすることができた。
２．単一B細胞から、直接モノクローナル抗体を取得する新規な手法であるEcobody法を用いて、上皮成長因子受容体などの立体構造認識するウサギモノクローナル抗体候補の取得方法の効率化を目指し、プライマー配列の再検討を行い、遺伝子取得効率を向上させた。また３Dプリンターを用いたB細胞分取方法について検討した。
３．マイクロバンド電極上にウェルアレイを作製し，各ウェルに選択的に細胞を捕捉することや選択的に放出することを可能とした．正の誘電泳動を用いて抗原を固定化したウェルに導入した抗体発現細胞に，負の誘電泳動を作用させると抗体発現細胞をウェル内に留め，未発現細胞をウェル外へと除去することができた．また，ポーラス膜を利用することにより，膜上の任意の位置に微粒子や細胞のパターン形成を可能にした．さらに，各孔内に単一細胞を導入することができた．
４．人工脂質膜へ、GPCR(β2AR)を提示する組換えバキュロウイルスの出芽粒子を膜融合することでマイクロビーズ等に展開する方法の検討に進んだ。混和の膜融合条件により、再構成膜の性状に差異が認められため、提示された組換え膜受容体が再構成膜上により均質に分布するよう条件を改善した。さらに提示された受容体を抗原に抗体との反応を検討し、特異的認識が顕著となるブロッキング条件などを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．β2ARおよびCRHR1を含む複数のGPCRに対する立体構造特異的モノクローナル抗体の作製を示すことができた。この結果は、組換えプラスミドベクターを用いたDNA免疫法による目的のB細胞感作に起因する。さらに、標的タンパク質（β2ARまたはCRHR1）発現組換えミエローマ細胞を用いて、B細胞受容体を介した抗原抗体反応による目的の感作B細胞選択を可能とするSST法によって達成することができた。
２．高次構造認識ウサギモノクローナル抗体取得技術向上のための、プライマー再設計や細胞チャンバーの設計・試作などの進捗がみられた。
３．バンド電極上にマイクロウェルアレイを形成することにより，アレイ化した細胞の中から目的の細胞をウェル外へと排除して回収することができた．ウェル内に抗原を固定化することにより，目標通り有用な抗体を発現する細胞の濃縮が可能となった．デバイスの最適化を行い，高精度な細胞操作が可能となった．ポーラス膜を使用することにより，当初の予定以上の自由度で細胞パターンや細胞ペアを形成できた．
４．多様な抗原特異性を持った抗体産生細胞群の中から、分子標的治療薬抗体の候補となるモノクローナル抗体を選別できる評価系を構築することをめざし、そのモデルとしてGPCR(β2AR他)等を抗原提示する実験方法を検討してきた。マイクロビーズ上に、組換えバキュロウイルス出芽粒子を用いて、抗原となる組換えタンパク質を均一に分布する条件を見出し、さらにその抗体検出の検討まで進展した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．GPCRに対する立体構造特異的モノクローナル抗体作製を明らかにできたため、今後はGPCR以外の膜タンパク質（受容体）に対する本新規法の有用性を検証する。さらに、立体構造特異的モノクローナル抗体の一括作製を目ざしたダブルターゲティング法の開発、また、2分子会合体タンパク質を特異的に認識できる立体構造特異的モノクローナル抗体の作製へと進展させたいと考えている。
２．効率化されたEcobody方法を用いて、多数のウサギモノクローナル抗体を取得し、その解析を進める。さらにDNA免疫法を組み合わせ、高次構造認識ウサギモノクローナル抗体取得を試みる。
３．H30年度までに構築できた細胞の自由度の高い操作方法を利用し，迅速な細胞アレイおよび細胞ペアの形成，高効率細胞融合，抗原抗体反応を用いた有用な抗体を産生するハイブリドーマの識別，その細胞の回収を一連で行えるデバイスの開発を目指し，各項目の最適化を徹底的に行う．特に，細胞濃縮および回収技術の開発に取り組み，細胞母集団の中から有用な細胞を選別するとともに，回収して使用できるレベルにする．また，ポーラス膜を積極的に利用し，孔内での異種類細胞のペア形成と細胞融合に応用する．
４．分子標的治療薬抗体の候補となるモノクローナル抗体を選別できる評価系の構築をさらに進める。今年度までの進展により、組換えGPCRを安定にマイクロビーズ上の膜に再構成できることが確かめられた。今後は、提示する膜受容体の種類を増やすとともに、抗受容体抗血清を含む抗体分子との結合評価をさらに進め、立体構造認識の評価に適用可能となるよう、本方法の信頼性を高めていく。
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