2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of a next generation transgenic chicken platform for biopharmaceutical production
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17H03470
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
上平 正道 九州大学, 工学研究院, 教授 (40202022)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | バイオテクノロジー / トランスジェニックニワトリ / バイオ医薬品生産 / ゲノム操作技術 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
低コストでバイオ医薬品を生産するために、トランスジェニック鳥類を生体バイオリアクターとして利用するための新しい技術を開発することを目的として研究をすすめている。申請者はこれまで独自に、鳥類胚培養法、ウイルスベクターを用いた高効率遺伝子導入、卵管特異的な遺伝子発現システムの開発を行い、抗体などの組換えタンパク質を卵や体組織に生産するニワトリ・ウズラの作出に成功した。本研究では、近年進展が著しいゲノム編集技術と申請者が開発してきたセル・エンジニアリング技術を融合し、胚操作による細胞ゲノムへの部位特異的な遺伝子導入技術を開発し、トランスジェニックニワトリによるバイオ医薬品生産のためのユニバーサルプラットフォームの作製を試みるとした。当年度は、(1) CRISPR/Cas9ベクター作製（gRNAの選択）およびCRIS-PITCh用ノックインベクター作製、(2) CRIS-PITCh法によるターゲットノックインの細胞レベルでの評価系の構築および評価、(3) ニワトリ胚への遺伝子導入条件の検討、に取り組んだ。
ニワトリ卵白タンパク質であるオボアルブミンとリゾチームのゲノム遺伝子領域におけるイントロンあるいは3’UTRに目的遺伝子をノックインしてこれらのタンパク質と同時に生産させるためのガイドRNA（gRNA）の設計を行い、SSA（single-strand annealing）アッセイにより改変効率が高いgRNAを選択した。また、オボアルブミンやリゾチームと目的遺伝子が共発現するようにCRIS-PITCh用ノックインベクターを作製した。細胞培養でCRIS-PITChベクターの有効性を確認するための評価系を構築し、ニワトリ胚性繊維芽細胞への最適な遺伝子導入条件を決定した。さらに、エレクトロポレーションを用いたニワトリ胚への遺伝子導入条件を検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．CRISPR/Cas9ベクター作製（gRNAの選択）およびCRIS-PITCh用ノックインベクター作製 ニワトリ卵白タンパク質であるオボアルブミンとリゾチームのゲノム遺伝子領域におけるイントロンあるいは3’UTRに目的遺伝子をノックインしてこれらのタンパク質と同時に生産させるために、CRISPR/Cas9システムによる特異的な染色体部位のターゲティングのためのガイドRNA（gRNA）の設計を行った。CRISPR/Cas9システムをベースに、ゲノム編集技術を用いた遺伝子ノックインにおいて、非常に限られた短い相同領域（～20bp）を用いた標的ゲノム領域への正確な遺伝子挿入技術として、CRIS-PITCh法を用いるために、オボアルブミンやリゾチームと目的遺伝子が共発現するようにCRIS-PITCh用ノックインベクターを作製した。
２．CRIS-PITCh法によるターゲットノックインの細胞レベルでの評価系の構築および評価 ニワトリ細胞ゲノム上のオボアルブミンや卵白リゾチーム遺伝子座への遺伝子ノックインのために作製したCRIS-PITChベクターの有効性を確認するための細胞培養での評価系を構築した。レポーター遺伝子を用いて、ニワトリ胚性繊維芽細胞への最適な遺伝子導入条件を決定した。
３．ニワトリ胚への遺伝子導入条件の検討 本研究ではCRIS-PITChベクターのニワトリ胚への導入にエレクトロポレーション法を用いている。胚内での遺伝子導入のターゲット細胞としては、将来生殖細胞に分化する始原生殖細胞（PGC）とする。CRIS-PITChベクターのニワトリ胚への導入に先立って、最適な遺伝子導入条件についてレポーター遺伝子を有するプラスミドを使って検討した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．CRIS-PITCh法によるターゲットノックインの細胞レベルでの評価系の構築および評価 前年度に引き続き、ニワトリ細胞ゲノム上のオボアルブミンや卵白リゾチーム遺伝子座への遺伝子ノックインのために作製したCRIS-PITChベクターの機能評価を行う。CRISPR/Cas9システムを機能させるベクター（pX330）とPITChノックインベクターの２つのベクターの量比の影響を調べる。細胞としては孵卵5～10日目のニワトリ発生胚から採取した胚性繊維芽細胞を用いる。レポーター遺伝子を用いて、ニワトリ胚性繊維芽細胞への最適な遺伝子導入条件（プラスミド濃度、パルス強度、印加時間など）を決定する。
２．ワトリ胚への遺伝子導入条件の検討 前年度において、CRIS-PITChベクターのニワトリ胚への導入に先立って、最適な遺伝子導入条件をレポーター遺伝子を有するプラスミドを使って検討した。胚内での遺伝子導入のターゲット細胞としては、将来生殖細胞に分化する始原生殖細胞（PGC）としたが、初期胚での遺伝子導入操作は困難であり、コンスタントに胚細胞へ遺伝子導入することができなかった。高効率にPGCへ導入するには印加時の電極の位置が非常に重要であることがわかった。今年度は、電極の形状を変えて胚全体に印加可能なものを用いる。導入効率の評価は、遺伝子導入処理胚を２週間胚培養して体組織や生殖巣での導入遺伝子の保持率およびレポーター遺伝子発現量で評価する。
３．遺伝子導入ニワトリの作製 細胞培養レベルでの評価により有効であることが確かめられたCRIS-PITChベクターを用いて、胚盤葉期のニワトリ胚への適用で最適化されたエレクトロポレーション条件によって遺伝子導入を行い、遺伝子導入胚を胚培養によって人工孵化させる。成鳥になったら輸卵管組織や卵白中での導入遺伝子発現を評価する。
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