2019 Fiscal Year Annual Research Report
Alzheimer-specific alterations of 4 repeat tau for pathological diagnosis and its clinical application for CSF testing
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17H03555
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
内原 俊記 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 特任教授 (10223570)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉田 眞理 愛知医科大学, 付置研究所, 特命研究教授 (60288545)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 4リピートタウ / 脱アミド化 / アルツハイマー病 / 進行性核上性麻痺 / 髄液診断 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の当面目標は、疾患により異なるタウ沈着病態を反映する D279-4Rタウを髄液中で定量するELISA系を確立し臨床応用することである。すでにポリクローナル抗体でこのＤ279エピトープ発現がADに豊富で、PSPに乏しいことを明らかにしたが、安定したELISA系の確立のために、新たにD279-4Rモノクローナル抗体を作成する。特許申請し審査が終了した免疫吸着法を用いれば、 D279への反応性は高いがN279への反応性は乏しいクローンを選定できる。並行して新たなD279ポリクローナル抗体も改めて作製し、このエピトープの特徴を複数の抗体で検証する。以上により4Rタウに対する抗体はi)N279特異的なRD4(市販品), ii)N279/D279両者に反応する４R(市販品), iii)D279特異的なD279-4R(モノクローナルおよび、ポリクローナル抗体一部作成済)が得られることを最初の目標とする。ポリクローナル抗体から精製したD279-4R分画はAD病変を陽性に染するが、PSP例のタウ病変を陽性に染色しないことを2019年に論文発表した。 ADと PSP・CBD脳をD279-4R抗体(モノクローナルおよびポリクローナル)を用いて比較する。ADとPSP/CBD例の異なる部位D279-4R陽性の病変を網羅的に検索する。検索の範囲を基底核や脳幹へ拡大しCBD例も加えて例数を増やし、包括的な検索を進める。並行して、 剖検脳を用いた Western blotを行い D279-4R抗体の特異性を生化学的にも確認し、ポリクローナル、モノクローナル抗体で比較する。その上で、D279-4R特異的なELISAを構築し、髄液診断の精度を高めることが第一の目的となる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ポリクローナル抗体の作成：抗原に用いるD279を含む4Rタウ特異的ペプチドの配列を最適化して家兎を免疫した。いずれも市販抗体と同様にN279/D279に反応するが、免疫吸着法を用いてN279への親和性に乏しい分画が同様に得られることを確認した。
モノクローナル抗体の作成: D279に親和性の高いマウスハイブリドーマ樹立を試みたが成功しなかった。そこでD279抗原で免疫した家兎脾臓よりヒトIgGvariable regionのみのcDNA libraryを作成し、大腸菌に発現させてD279抗体に反応する105クローンを樹立したが、力価が不十分であった。そこで同様に免疫した家兎脾臓のB細胞からD279-4Rエピトープに対する抗体を発現しているものをsortingし、その遺伝子からIgGを再構成し、複数の候補クローンを得た。これらのクローンを安定的発現系に移したが、期待された特性のIgG発現は確認できなかった。
特許出願：特願2017－098795「4リピートタウの質的違いを検出する特異的結合試薬、これを用いた検査方法、検査キット、及び医薬のスクリーニング方法」【発明者 内原俊記 100%】の審査請求を2020年5月に開始し、特許として認定するとの査定の連絡を2021年5月に受けた。
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| Strategy for Future Research Activity |
D279特異的家兎モノクローナル抗体の作製：免疫原のペプチドデザインを既に最適化し、家兎でD279特異的分画を含むポリクローナル抗体の産生があることを、繰り返し確認した。免疫した家兎脾臓のB細胞からD279-4Rエピトープに対する抗体を発現しているものをsortingする条件も今回最適化し、その遺伝子からIgGを再構成する方法でいくつかのクローンを選別することを再度試みる。
病態解明：これらの抗体を用いてADとPSPヒト剖検脳のdot blot, Western blot, 免疫組織化学で検証する。
髄液ELISAへの応用：D279特異的抗体を用いた髄液タウの測定でADとPSPを区別できるか検討する。モノクローナル抗体を用いた髄液ELISAの確立が最も望ましいが、抗体の樹立は容易ではない。既に実績のある家兎ポリクローナルIgGのD279特異的分画を用いたELISA系の確立を並行してめざす。
画像診断や治療法への発展：AD特異的な4Rタウ抗体は他に報告がないが、特異度、感度の高いモノクローナル抗体が得られれば、ヒト脳タウ沈着の分布のトレーサーや、タウ免疫治療の主働役として発展させられる可能性がある。
特許権の確立と拡大：特許として確定した本発明の市場化を念頭に、病態解明をすすめ市場価値をアピールする。今後モノクローナル抗体が得られれば、海外特許出願も念頭に関連手続きを進める。
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[Journal Article] Secondary cardiac involvement in anti-SRP-antibody-positive myopathy: an 87-year-old woman with heart failure symptoms as the first clinical presentation.2020
Author(s)
Hara A, Amano R, Yokote H, Ijima M, Zeniya S, Uchihara T, Yada S, Masumura M, Takei H, Nishino I, Toru S,
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Journal Title
BMC Neurol
Volume: 20
Pages: 29
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] おだやかな看取りを明日に活かすみち-在宅看取り例の在宅主治医によるCPC臨床提示の５例-. In おだやかな看取りを明日に活かすみち-在宅看取り例の在宅主治医によるCPC臨床提示の５例-2020
Author(s)
内原俊記, 融衆太, 三五美和, 中村洋一, 中島美知子, 今村昌幹, 安西宣恵, 廣川勝昱, 北川昌伸, 入江徹也,
Organizer
第２回日本在宅医療連合学会大会
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