2017 Fiscal Year Annual Research Report

補体様分泌因子とグルタミン酸受容体クロストークによるシナプス成熟の分子機構解明

Research Project

Project/Area Number	17H03562
Research Institution	Keio University
Principal Investigator	松田恵子慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (40383765)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	荒井格慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (00754631)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2021-03-31
Keywords	シナプス / 海馬 / グルタミン酸受容体 / 補体
Outline of Annual Research Achievements	神経細胞同士の間に新しくシナプスを形成させる作用を持つ分子は、シナプスオーガナイザーと総称され、シナプス形成を引き起こす分子として機能する数多くの分子が同定されてきた。しかしながら、どのように、特有のシナプス伝達様式を持つシナプスの個性が生み出されるのかについて、その分子メカニズムには不明な点が残されている。免疫系古典的補体経路タンパク質C1qや腫瘍壊死因子TNFが属するC1q/TNFファミリーの一員であるCbln1は、グルタミン酸受容体GluD2とneurexinに同時に結合し、小脳顆粒細胞－プルキンエ細胞シナプス形成を推し進める。また申請者は、C1ql2とC1ql3はシナプス後部のカイニン酸型グルタミン酸受容体のアミノ末端領域に直接結合し、カイニン酸受容体局在をシナプス前部からシナプスを越えて規定すること、同時にneurexin3受容体に結合することを発見し、シナプスを跨いでneurexin3-C1ql2/3-カイニン酸受容体複合体が形成されるという分子基盤を提唱した。海馬苔状線維―CA3シナプスにおいて、C1ql2/3は苔状線維末端から分泌し、シナプス前部軸索末端表面を含むシナプス間隙に局在化する。この分泌機構やシナプス局在化機構へのneurexin3受容体の関与の可能性を探るため、C1ql2 C1ql3と結合するneurexin3スプライシングアイソフォーム発現パターンの時空間的解析を行った。スプライシング特異的な発現パターンの解析は、ターゲットとなる領域の長さが短い場合in situ hybridization解析は困難である。そこでneurexin3のexon25bにストップコドンとPST配列‐P2A配列‐EGFP cDNAをノックインした、neurexin3 exon25b EGFPノックインマウスを作製し、発現パターンを時空間的に解析した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason neurexin3 exon25b EGFPノックインマウスは、この組み換え遺伝子をhomoに持つと、exon25bコード領域を欠損したneurexin3を発現するマウスとなる。海馬苔状線維―CA3シナプスにおいて、C1ql2/3は苔状線維末端から分泌し、シナプス前部軸索末端表面を含むシナプス間隙に局在化し、シナプス後部のカイニン酸受容体のシナプス局在を制御する。このC1ql2/3分泌機構やシナプス局在化、カイニン酸受容体の局在化機構へのneurexin3受容体の関与の可能性を探るため、このneurexin3 exon25b領域欠損マウスを用いて解析を行った。このマウスのGFP発現解析と、in situ hybridizationの結果から、neurexin3 exon25b は海馬苔状線維―CA3シナプスが形成され始める、P8-9を中心に発現が上昇していることが明らかとなった。しかしながらneurexin3 exon25bを欠損させたマウスにおいても、正常にC1ql2/3は分泌し、カイニン酸受容体とシナプスにおいて共局在することが明らかとなった。このneurexin3-C1ql2/3-カイニン酸受容体複合体のシナプス局在自体にはneurexin3 exon25bの関与は少ない模様であった。一方、neurexin3 exon25b領域欠損マウスにおいて、シナプス前部の機能に異常表現型が見られ、このシナプス前部機能に対する、複合体によるシナプス間隙を超えての調節機構の関与を明らかにするため、カイニン酸受容体欠損マウス、C1ql2/3欠損マウスにて、同様の表現型が見られるかを解析予定である。
Strategy for Future Research Activity	neurexin3-C1ql2/3-カイニン酸受容体複合体形成による、シナプスを超えてのシナプス前部機能の調節機構を明らかにする目的で、カイニン酸受容体欠損マウス、C1ql2/3欠損マウスにて、neurexin3 exon25b領域欠損マウスと同様の表現型が見られるかを解析予定である。また、近年カイニン酸受容体を欠損させたマウスでは、幼若期の海馬CA3シナプスにおいて、苔状線維軸索末端の形状が未成熟であるという報告がなされた。このことから、カイニン酸受容体によるシナプスの形態的成熟が、C1ql2、C1ql3を間に挟みシナプス前部のneurexin3と相互作用することに依存する可能性を探るため、C1ql2/3欠損マウス、neurexin3 exon25b領域を欠損させたマウス、カイニン酸受容体欠損マウスの苔状線維軸索末端の微細な形態を、Light sheet顕微鏡、二光子レーザー顕微鏡、さらに電子顕微鏡にて詳細に解析することで明らかとする。電子顕微鏡観察のpreliminaryな結果では、C1ql2/3欠損マウスにおいても、シナプス不全は観察されていたが、カイニン酸受容体欠損マウスに観察されるシナプス形成異常が最も顕著であった。この結果はC1ql2/3ーneurexin3 exon25bを介さない、独自のシナプス分化機構を示唆している。この結果から、カイニン酸受容体が直接誘導する、シナプス分化機構が示唆された。この分子基盤とカイニン酸受容体における責任領域を明らかにする目的で、欠損マウスへのウィルス発現によるレスキュー実験を行う。