2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of mouse-non-human primate chimera analysis innovating evaluation methods of human pluripotent stem cells
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17H03568
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
杉山 文博 筑波大学, 医学医療系, 教授 (90226481)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
水野 聖哉 筑波大学, 医学医療系, 助教 (10633141)
高橋 英機 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, 副部門長 (40446521)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 外胚葉可視化マウス / 中胚葉可視化マウス / 内胚葉可視化マウス / 多能性幹細胞 / 異種間キメラ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
多能性幹細胞と初期胚とのキメラ形成は最も厳格な多能性評価方法である。しかし、ヒト多能性幹細胞は異種キメラ形成能を欠くことからこの多能性評価が困難であった。最近マウス原腸胚へのヒト多能性幹細胞注入により効率に多能性幹細胞が統合され、運命決定されることが明らかとなった。しかしながら、多能性幹細胞がどの胚葉系の組織に駐在して移動・分化をしていくのか継時的に容易に解析することは困難であった。そこで申請者はヒト多能性幹細胞評価を革新するため、三胚葉を蛍光mappingできるマウスを開発し、非ヒト霊長類であるマーモセット多能性幹細胞とMIERU（ミエル、Multi-color Imaging of Embryonic Development by Reporter Units）マウス原腸胚にて高精度Stage-matching異種間キメラ解析システムを構築することを本研究の目的とした。平成30年度は外胚葉、内胚葉、中胚葉を可視化するために蛍光タンパク遺伝子（tdTomato、EGFP、Tag-BFP）をCRISPR/Cas9システムを用い、標的とする遺伝子（Orthodenticle homeobox 2、Sex determiningregion Y-box 17、Brachyury）に対してバイシストリックシステムにてノックインしたレポーターマウス（Sox17-2A-EGFP、Otx2-2A-tdTomato、T-2A-TagBFP）におけるレポータータンパク発現の局在を詳細に解析した。また、3種レポーター蛍光遺伝子を保有するマウス系統の作出を進めている。さらに、臓側内胚葉を可視化するためのレポーターマウスの作製に成功した。そして、マーモセットの人工多能性幹細胞について胎児線維芽細胞より樹立を引き続き続けている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
各胚葉を可視化する三種類の新規バイシストロニック・レポーター・ノックインマウスの作製を試みた。まず、CRISPR/Cas9を用いて、P2Aペプチド配列と融合された蛍光タンパク質遺伝子EGFP、tdTomato、TagBFPをマウス受精卵のSox17遺伝子（内胚葉マーカー）、Otx2遺伝子（外胚葉マーカー）、T遺伝子（中胚葉マーカー）の終止コドン直前にそれぞれ挿入させた。結果、Sox17-P2A-EGFP系統、Otx2-P2A-tdTomato系統、T-P2A-TagBFP系統のファウンダーマウスが得られた。次に、全系統においてホモ接合型ノックインマウスを作製し、形態学的な異常は見られず妊娠や出産が可能であることを確認した。胎齢6.5日～E8.5日のノックインマウス原腸胚を用いてレポータータンパク質を蛍光実体顕微鏡観察したところ、それらシグナルは胚葉特異的な発現様式で検出された。さらに、胎齢7.5日胚においてレポーターと標的マーカータンパク質の胚内局在を蛍光免疫染色にて解析したところ、発現部位は重複していることが確認された。以上の結果から、本研究で作製されたSox17-P2A-EGFP系統、Otx2-P2A-tdTomato系統、T-P2A-TagBFP系統は各胚葉を可視化するマウスとして多能性幹細胞の原腸胚でのキメラ形成能を評価するためのツールとして用いることに問題はないことが確認された。臓側内胚葉をtdTomato以上の長波長域で赤蛍光するLefty1バイシストリックE2-Crimsonレポーターマウスの作製より、ファンダ―マウスが得られ、子孫の作出を進めている。マーモセット胎児線維芽細胞よりのiPS細胞樹立においては可塑化状態に大きなばらつきがあり、より良い条件にて引き続きその樹立を進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Stage-matching異種間キメラマウス解析に空間的な解析システムを加えるため、①原腸胚より三胚葉がmappingできるマウスの開発、②ヒトPS細胞の代替として非ヒト霊長類のマーモセットiPS細胞によるヒト多能性幹細胞を評価する高精度異種間キメラ解析システム基盤ツールの手技を開発する。
CRISPR/Cas9システムによりマウスOtx2遺伝子終止コドン直上流に2A配列を介しバイシストリックにtdTomatoレポーター遺伝子を導入したOtx2-2A-tdTomatoマウス、CRISPR/Cas9システムによりマウスBrachyury（T）遺伝子終止コドン直上流に2A配列を介しバイシストリックにTagBFPレポーター遺伝子を導入したマT-2A-TagBFPマウス、CRISPR/Cas9システムによりマウスSRY Sox17遺伝子終止コドン直上流に2A配列を介しバイシストリックにEGFPレポーター遺伝子を導入したSox17-2A-EGFPマウスを自然交配し、原腸胚内で外胚葉・中胚葉・内胚葉が同時に識別可視化できるトリプルレポーター遺伝子ノックインであるMIERUマウスの作出を行う。臓側内胚葉可視化のためのLefty1-2A-E2-Crimsonマウスについては原腸胚におけるレポータータンパク発現を蛍光観察で詳細に特徴化し、MIERU系統の一系統として加える。そして、マーモセットiPS細胞を用い、MIERUマウスの有用性を検討する予定である。
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