2018 Fiscal Year Annual Research Report
乳癌・卵巣癌治療の分子基盤としてのグアニン4重鎖解除機構の解析
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17H03585
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| Research Institution | St. Marianna University School of Medicine |
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Principal Investigator |
太田 智彦 聖マリアンナ医科大学, 医学研究科, 教授 (60233136)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 乳癌 / 卵巣癌 / 相同組換修復 / グアニン4重鎖 / G4安定化剤 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
①HERC2とRPAの細胞内局在の解析：非ストレス時にHERC2はRPA2と核内に共局在するが、hydroxyurea添加後にRPA2が1本鎖DNA（ssDNA）上に集積し、核内fociを形成する際にはHERC2と共局在しないことが判明した。②HERC2とRPAの結合様式の解析：上記を反映し、HERC2がssDNA上に結合したRPAにanchorするのではなく、ssDNA上にRPAをreleaseすることを、in vitroにてHERC2-RPA複合体とビオチンラベルssDNAを混和させ、アビジンpulldownにて証明した。すなわち、HERC2がプールしていたRPAを複製ストレス下においてssDNA上に供給して機能を果たすことが示唆された。③グアニン４重鎖（G4）抑制におけるHERC2の役割：平成29年度以前の結果からHERC2のノックダウン（KD）細胞ではG4が蓄積することがわかっていたが、この蓄積がHERC2に結合するBLMおよびWRNヘリカーゼの機能に起因することをエピスタシス解析にて検討した。その結果、G4抑制において、BLMとWRNはエピスタシスな関係にないが、それぞれはHERC2とエピスタシスな関係にあることが判明した。さらに、BLMとWRNを同時に抑制した際に生じるG4の蓄積がHERC2単独の抑制によるG4蓄積と同等で、BLM, WRN, HERC2のトリプルKDでその量が変化しないことから、HERC2が両ヘリカーゼを統括する形で上流で制御していることがわかった。④薬剤感受性の解析：shRNAでHERC2を抑制した細胞およびHCT116ΔE3/ΔE3細胞のG4安定化剤pyridostatinに対する感受性をClonogenic survivalアッセイにて解析したところ、これまでわかっていたtelomestatinと同様に、感受性が有意に亢進していた。⑤ The Cancer Genome Atlas（TCGA）データを用いたin silico解析において乳がんを始め、多くのがんでHERC2の有意な発現低下を認めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画の8割程度は実験が終了しており、また、今後の発展に繋がる新規知見も得ていることから、おおむね順調と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
①HERC2とRPAの結合部位の解析：平成30年度までの結果から、HERC2がBLMおよびWRNヘリカーゼ複合体の足場タンパク質として働き、replication protein A (RPA)をリクルートする結果を得た。そこで、HERC2とWRNの結合様式を検討する。具体的にはHERC2のフラグメントを作成し、免疫沈降にてRPAとの結合部位をマッピングする。さらに、結合にプロテアソームの阻害がどのように影響するかを解析する。
②HERC2によるG4制御がBLM機能不全に起因することを証明する：平成30年度までの結果から、CRISPR/Cas9にて作成したHERC2 E3活性のないΔE3/ΔE3細胞において、RPA2のユビキチン化が抑制されることを見出した。そこで、この細胞にRPAと結合し、HECTドメインを有するHERC2のフラグメントをadd-backしてユビキチン化をレスキューできることを確認する。
③RPA2リン酸化におけるHERC2の役割：平成30年度までの結果から、HERC2のノックダウンがRPA2のSer33リン酸化に必須であることを見出した。そこで、どのような状況下でHERC2が役割を果たしているかを詳細に検討するため、mitomycin C, hydroxyurea, CPT-11, aphidicolin に誘導されるSer33リン酸化、さらに強いストレスによって生じるSer4/8のリン酸化におけるHERC2ノックダウン、あるいはΔE3/ΔE3の影響を解析する。また、ATRおよび、もうひとつのRPAユビキチンリガーゼであるRFWD3のノックダウンとの相互作用について検討する。
④HERC2によるG4制御がRPA機能不全に起因することを証明する：平成30年度までの結果から、HERC2およびそのE3活性がG4制御に重要で、特にBLMとWRNの上流で作用していることが判明した。そこで、HERC2を介したBLMおよびWRNのG4抑制作用がRPAを介していることを、それぞれを組み合わせたノックダウンにおけるG4 fociを蛍光免疫染色にて検出し、エピスタシスにて解析する。
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[Journal Article] HERC2 facilitates BLM and WRN helicase complex interaction with RPA to suppress G-quadruplex DNA.2018
Author(s)
Wu W, Rokutanda N, Takeuchi J, Lai Y, Maruyama R, Togashi Y, Nishikawa H, Arai N, Miyoshi Y,Suzuki N, Saeki Y, Tanaka K, Ohta T.
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Journal Title
Cancer Res.
Volume: 78
Pages: 6371-6385
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Journal Article] Fbxo22-mediated KDM4B degradation determines selective estrogen receptor modulator activity in breast cancer.2018
Author(s)
Johmura Y, Maeda I, Suzuki N, Wu W, Goda A,Morita M, Yamaguchi K, Yamamoto M, Nagasawa S, Kojima Y, Tsugawa K, Inoue N, Miyoshi Y, Osako T Akiyama F, Maruyama R, Inoue JI, Fukukawa Y, Ohta T, Nakanishi M.
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Journal Title
J Clin Invest.
Volume: 128
Pages: 5603-5619
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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