2017 Fiscal Year Annual Research Report
大腸がんの形成及び治療薬抵抗性獲得に関わるドライバー遺伝子の同定
| Project/Area Number |
17H03586
|
|---|
| Research Institution | Kanazawa University |
|---|
Principal Investigator |
武田 はるな 金沢大学, がん進展制御研究所, 助教 (80647975)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 大腸がん / マウスモデル / 治療抵抗性 / ドライバー遺伝子 / スクリーニング |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
1)CRISPRを用いたドライバー遺伝子同定
ヒトの大腸がん組織において、変異頻度が低頻度でありパッセンジャー遺伝子であるのかドライバー遺伝子であるのかの区別が困難である遺伝子の中で、特にがん抑制候補遺伝子と考えられるものに着目し、がん化機能の検証を行い、新規ドライバー遺伝子の同定へと結びつけることを目的としている。本年度は、がん化能の検証実験を行うための実験系の確立を行った。検証に用いる細胞は、マウス消化管上皮由来の腫瘍オルガノイドを用いた。Cas9をレンチウイルスにて導入し、Cas9を恒常的に発現するオルガノイドをまず樹立した。次に、10の候補遺伝子を標的としたgRNAで構成されるレンチウイルスライブラリーを3種類作成した。Cas9を発現するオルガノイドへgRNAライブラリーを導入し、その後免疫不全マウスの皮下に移植したところ、腫瘍形成が誘導された。腫瘍ゲノムを抽出し、次世代シーケンサー解析にてgRNAの頻度解析を行い、腫瘍形成に関与する標的遺伝子を抽出した。次に、抽出された3つの標的遺伝子1つずつを個別にオルガノイドでノックアウトしマウスに皮下移植すると腫瘍形成が誘導された。ノックアウトしない場合は腫瘍形成が誘導されないことより、これら３つの遺伝子が新規大腸がん抑制遺伝子であることを証明した。これらの遺伝子は、大腸がん治療薬の新規標的遺伝子となる可能性がある。
2)大腸がん治療薬への抵抗性を示す遺伝子のスクリーニング
Sleeping Beautyトランスポゾンを用いたスクリーニングを行うために、トランスポゼースを発現するSB11ノックインマウスとトランスポゾンを発現するT2/Onc2マウスを交配し、SB11:T2/Onc2マウスを得た。腫瘍形成効率を上げるためにKrasG12Dの変異を更に導入した。次年度はこれらマウスの数を増やし、腫瘍形成を誘導する予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1)CRISPRを用いたドライバー遺伝子同定
がん化能の検証実験を行うための実験系の確立を行った。検証に用いる細胞は、マウス消化管上皮由来の腫瘍オルガノイドを用いた。当初の計画であるCas9タンパク質とgRNAの複合体をエレクトロポレーションで導入する方法では遺伝子ノックアウトが確認されなかったので、Cas9をレンチウイルスにて導入し、Cas9を恒常的に発現するオルガノイドをまず樹立した。次に、10の候補遺伝子を標的としたgRNAで構成されるレンチウイルスライブラリーを3種類作成した。Cas9を発現するオルガノイドへgRNAライブラリーを導入し、その後免疫不全マウスの皮下に移植したところ、腫瘍形成が誘導された。腫瘍よりゲノムを抽出し、次世代シーケンサー解析にてgRNAの頻度解析を行い、腫瘍形成に関与する標的遺伝子を抽出した。抽出された3つの標的遺伝子1つずつを個別にオルガノイドでノックアウトしマウスに皮下移植すると腫瘍形成が誘導された。ノックアウトしない場合は腫瘍形成が誘導されないことより、新規大腸がん抑制遺伝子の同定に成功した。この中には、生体の発生過程に重要なシグナル経路を制御する遺伝子も含まれている。
2)大腸がん治療薬への抵抗性を示す遺伝子のスクリーニング
Sleeping Beautyトランスポゾンを用いたスクリーニングを行うために、トランスポゼースを発現するSB11ノックインマウスとT2/Onc2トランスポゾンを発現するマウスを交配し、SB11:T2/Onc2マウスを得た。さらに、腫瘍形成効率を上げるためにKrasG12Dの変異を更に導入した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
1)CRISPRを用いたドライバー遺伝子同定
次年度以降は、確立されたがん化能検証実験系を用いて、検証する遺伝子の数を増やし新規大腸がん抑制遺伝子の同定へと結び付けていくと同時に、今年度同定した遺伝子の機能解析をRNAシーケンスなどの手法を用いて行う予定である。さらに、CRISPR-Cas9の標的ゲノム領域の配列解読を行い、どのような遺伝子変異が誘導されているかを確認する。これは、gRNAの標的ゲノム領域近傍をPCRにて増幅し、PCR産物を次世代シーケンサー解析することで確認する。
また、がん細胞のマウスへの移植方法を、皮下のみでなく脾臓や大腸へと移植する方法を習得し試す予定である。脾臓への移植はがんの転移をモデルしていると考えられ、大腸への移植は同所移植となるため、最もヒトの大腸がんをモデルしていると考えられる。これにより、がんの微小環境の違いによりどのような遺伝子変異が優位となるかを解析することが可能となる。
2)大腸がん治療薬への抵抗性を示す遺伝子のスクリーニング
消化管上皮細胞でKrasG12Dの変異を発現するマウスに、Sleeping Beautyトランスポゾンシステムを導入したマウス(SB11:T2/Onc2:KrasG12D)の数を増やし、消化管の腫瘍形成を誘導する予定である。また、これらのマウスよりオルガノイドを樹立し、培養液中に大腸がん治療薬やシグナル阻害剤を加え、耐性となる細胞を得る予定である。
|
-
-
[Journal Article] p120-Catenin is an obligate haploinsufficient tumor suppressor in intestinal neoplasia2017
Author(s)
1.Sarah P. Short, Jumpei Kondo, Whitney G. Smalley-Freed, Haruna Takeda, Michael R. Dohn, Anne E. Powell, Robert H. Carnahan, Mary K. Washington, Manish Tripathi, D. Michael Payne, Nancy A. Jenkins, Neal G. Copeland, Robert J. Coffey and Albert B. Reynolds
-
Journal Title
J Clin Invest.
Volume: 127
Pages: 4462-4476
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
-
-
-
