2017 Fiscal Year Annual Research Report
Basic research for the development of a novel CAR-adaptor T cells by an advanced imaging system
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17H03600
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| Research Institution | Tokyo Medical University |
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Principal Investigator |
横須賀 忠 東京医科大学, 医学部, 主任教授 (10359599)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
矢那瀬 紀子 東京医科大学, 医学部, 講師 (10210303)
町山 裕亮 東京医科大学, 医学部, 講師 (40704606)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 免疫学 / 細胞療法 / 分子イメージング / シグナル伝達 / キメラ抗原受容体T細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年加速するがん免疫療法開発の中でも、キメラ抗原受容体T細胞（Chimeric antigen receptor-T cell : CAR-T cell）療法の技術革新と臨床応用は目覚ましい。一方、受容体に限ったデザインに留まっている点や、臨床応用が先行しその作用機序の解明が未解決な点など、残された課題も多い。本応募研究では、革新的イメージングシステムの構築、CAR-T細胞のシグナル伝達経路の可視化、CAR-T細胞のがん細胞傷害機構の解明、細胞内シグナル伝達分子を導入した新たなCARの設計を行い、より高い殺傷機能と容易な活性調節機構をもつ次世代CAR-T細胞の創出を目的とする。分子イメージングを基盤とした刷新的な解析技術によって、これまでのCAR-T研究とは異なる見地から斬新なCARの創出が期待できると考えている。
まず、分子イメージングの視点からhCD19 CAR-T細胞の抗原認識と活性化、がん細胞傷害活性の分子メカニズムを解明することにした。そしてその結果を基に、TCR下流の細胞内シグナル伝達分子を導入したCAR-T細胞キメラ受容体を作製し、より強力ながん細胞傷害活性を持ち、一方で傷害活性の調節が容易であり、かつ安全な細胞治療が期待できる新規CAR-T細胞の開発基盤を作ることを目指している。研究計画の方向性として、既存のCD19 CAR-T細胞の一分子イメージング実験系の構築、アダプター分子を導入した新規CAR-T細胞受容体のデザインと創出、E3ユビキチンリガーゼを導入した活性化調節機構のあるCAR-T細胞受容体のデザインと創出、NSGヒト化マウスを用いた新規CD19 CAR-T細胞のin vivo細胞傷害活性の検証、を予定している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
新規CAR-T細胞の開発基盤を作るため、hCD19 CAR-T細胞の抗原認識・活性化・がん細胞傷害活性の分子メカニズムを解明するためのイメージングシステムを構築した。Glycosylphosphatidylinisotol（GPI）アンカー型hCD19のタンパク質精製を行うための、hCD19の細胞外領域にGPIアンカーモチーフを付加し、そのキメラ分子hCD19-GPIを高発現させたハムスター腫瘍細胞株BHKを樹立した。精製の用いる抗hCD19抗体も確保した。共同研究としてベイラー医科大学Brenner Malcolm博士の研究室への訪問も実現し、定期的にテレビ会議を通して情報交換を行っている。hCD19-EGPFや-HaloTagキメラ分子を作成し、発現細胞株を樹立した。また、マウスのプライマリーCD8+ T細胞に導入しhCD19-CAR-Tがマウス細胞の実験系でも解析可能であることを確認できた。hCD19 CAR-T細胞とhCD19発現標的がん細胞とが接着する面、いわゆる免疫シナプスを共焦点レーザー顕微鏡にて画像取得し3-Dイメージング構築することで、hCD19 CARのクラスタリングを可視化できた。より高度な画像解析のため、分担者町山裕亮講師がイメージングの装置のバージョンアップと数理学的解析のプログラミングを行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
hCD19 CAR-T細胞のイメージング：hCD19-GPI蛋白精製とそれを組み込んだ抗原提示人工平面脂質二重膜＝プレイナーメンブレンを作成する。hCD19 CAR-T細胞受容体を蛍光ラベルし、その遺伝子導入細胞を確立する。このCAR-Tをプレイナーメンブレン上に落下させ、共焦点レーザー顕微鏡、N-SIM TIRFMにてCD19 CAR-T細胞受容体の挙動を観察する。
細胞傷害活性の評価：標的細胞となるマウスBリンパ腫細胞株WEHIにヒトCD19を遺伝子導入したトランスフェクタントを作成する。CD19 CAR-T細胞の活性化は、INF-γ産生のELISAもしくはELISPOTアッセイによって、また実際の細胞傷害活性は、CFSEでラベルした標的細胞もしくは死細胞の7-AAD染色によるフローサイトメトリーによって判定する。
アダプター分子を導入した新規CAR-T細胞受容体の作製：TCR下流で生理的にT細胞活性化因子として働くアダプター分子SLP-76、LAT、足場蛋白CARMA-1の分子結合領域を、CD19 CAR-T細胞受容体のCD3ζ鎖C末端に付加し、アダプター分子や足場蛋白の長さ、その下流で働く分子の選択性、結合領域を細分化したシグナル伝達等を考察しCD19 CAR-T細胞キメラ受容体のデザインを行う。
新規CAR-T細胞受容体に会合するシグナル伝達分子の検証：アダプター分子の下流のシグナル伝達分子が、それぞれの分子やそのドメインに対応してどの程度増幅されているか、生化学的方法と分子イメージングによるクラスター形成の増強の二方向から検証する。
SLP-76の導入によるCAR-T細胞受容体のクラスタリング増幅効果の検証：アクチン重合関連分子WASP、ADAP、Arp2/3、アクチンを指標として、Inside-outシグナルの増強を判定する。
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[Book] 生物物理2018
Author(s)
横須賀忠、若松英、矢那瀬紀子、秦喜久美、町山裕亮
Total Pages
64
Publisher
日本生物物理学会
ISBN
0582-4052
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