2018 Fiscal Year Annual Research Report
キノームの生理的基質同定に基づく細胞内シグナルパスウェイ大規模解析
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17H03605
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
石濱 泰 京都大学, 薬学研究科, 教授 (30439244)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | キナーゼ / リン酸化シグナル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
国内外のゲノムワイド関連解析により、様々な疾病原因は個々の遺伝子よりもシグナルパスウェイ毎の異常に集積されており、特にガンは十数種のパスウェイに原因遺伝子が分布することがわかってきた。これらのパスウェイにはすべてリン酸化シグナルが関わっており、その異常はガンそのものの発症因子ともなり、その進行、薬剤感受性および治療予後とも深く関わる。したがって、様々なパスウェイ毎のリン酸化動態を全体として理解することが、細胞内シグナル解析には必要とされる。本研究では、(1) キナーゼ毎に生理的基質を大規模に同定する方法を確立し、(2) それを500種のキナーゼについて適用し細胞内キナーゼ―基質相関を解明することにより、細胞内リン酸化ネットワークの分子基盤を明らかにし、(3) さらにこの基盤情報に基づいて、細胞内シグナルパスウェイ大規模解析法を確立することを目的としている。本年度は（２）について取り組んだ。ビオチンリガーゼ融合キナーゼ発現HEK293T細胞と野生型のHEK293T細胞を用意し、それぞれにビオチンを施した後、タンパク質抽出、ビオチン化タンパク質濃縮およびトリプシン消化を行い、LC/MS/MSにより測定した。その結果、CK2及びPKAの相互作用タンパク質として、それぞれ574種、518種のタンパク質が同定された。さらに、HEK293T細胞にCX-4945またはForskolinを施した後、細胞を回収し、タンパク質抽出、トリプシン消化、リン酸化ペプチド濃縮、およびTMT標識を行った後、LC/MS/MSによりリン酸化ペプチドを定量した。上記の、BioIDとin vivoリン酸化プロファイリング及びモチーフ配列評価の三つのフィルターにより、それぞれ約40種のCK2基質候補とPKA基質候補を抽出することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画通りに進行しており、おおむね期待通りの結果が得られているため。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度に引き続き(1)キナーゼ阻害薬ライブラリーを用いた生理的基質大規模同定、を行う。(2) キナーゼsiRNAライブラリーを用いた生理的基質大規模同定にかえて、Bio-IDを用いたキナーゼと相互作用する基質候補タンパク質の同定を行う。また(3) 外部シグナルを用いたパスウェイ毎の生理的基質大規模同定も行い、(4) キナーゼ―生理的基質情報に基づくパスウェイ解析ソフトウェアの開発を行う。（４）については、タンパク質相互作用情報に加えて、細胞内局在化情報なども付加した手法の開発を行う。さらに、バリデーションのため、細胞生物学的な検証実験も行う。
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