2018 Fiscal Year Annual Research Report
早期誘導遺伝子の転写スイッチを担うタンパク質複合体の立体構造解析
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17H03614
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
神吉 康晴 東京大学, アイソトープ総合センター, 助教 (00534869)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 疾患エピゲノミクス / VEGF / ヒストン修飾 / 血管生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、申請者が見出した新たなヒストン修飾変化に対する生物学的意義を解明し、その修飾が形成される分子機構、更にその立体構造を最新のクライオ電子顕微鏡技術を用いた単粒子解析で決定する。申請者はこれまでに、血管内皮細胞を用いて次世代シークエンサーを用いた網羅解析から、血管内皮細胞活性化に寄与する転写因子、エピゲノム修飾を報告しており(Kanki Y et al 2011 MCB, EMBO Jなど)、更に、最近の研究では血管内皮細胞活性時に形成される独自のヒストン修飾の組み合わせを同定している。そこで、本研究では、遺伝子座特異的な複合体の同定からその立体構造解析を行うことで、エピゲノム複合体の、生物学的のみならず、生物物理学的な本質を捉え、将来の創薬の足がかりとなるデータを得ることが目的である。
2年目にあたる平成30年度は、H3K27me3修飾、H2AK119Ub修飾に関与していると考えられるPolycomb Repressive Complex1,2 (PRC1, PRC2)複合体に関する解析を行った。高等真核生物では、PRC1はPRC1.1-1.6、PRC2はPRC2.1-2.2まで知られており、いずれも遺伝子発現を抑制する修飾として知られている。この中で、血管新生に関与するものを決定するために、siRNAを用いてtube formation assayを行った。その結果、PRC1やPRC2といった遺伝子発現を抑制する複合体を抑制した際にも血管新生関連転写因子の発現は抑制され、その結果としてtubeの形成も阻害されることが分かった。
今回見出した現象は、エピゲノム修飾でも過去に報告がなく、独特の複合体の関与が考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度の目標は、H3K4をトリメチル化する酵素複合体の同定、及び、H3K27トリメチル化の転写に対する意義の解明にあった。ヒト臍帯静脈内皮細胞に血管内皮成長因子（VEGF）を添加すると、抑制系ヒストン修飾であるH3K27me3が入ったまま、EGR3、EGR2といった早期誘導転写因子の転写が一過性に実行される。平成30年度の研究により、このH3K27me3修飾を入れている実態はPRC2であることを同定し、更に、PRC2をsiRNAでノックダウンすると、EGR3やEGR2の転写が抑制されることが分かった。
また、同時にこの領域の転写複合体を形成するもう一つの要素として、PRC1を同定した。PRC1にはPRC1.1-1.6まであるが、共通コンポーネントであるRING1A, RING1Bをノックダウンすると、上記EGR2、EGR3の転写が抑制され、血管新生も阻害されることを新たに見出した。
このように、平成30年度は、これまでに知られていない血管新生に関与するエピゲノム修飾因子を複数同定しており、研究は概ね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究最終年度にあたる平成31年度は、まずはこれまでに見出した現象の論文化を行う。これまでの成果で、血管新生に影響を与える因子を複数同定しており、論文化すれば、多数の読者の興味をひくことが予想される。
また、これとは別に遺伝子座特異的な複合体の網羅的な同定手法を確立させる。手法としては、EGR3の第1イントロンにガイドRNAを設計し、DNA切断酵素活性を無くしたdCas9-FLAGを用いて、遺伝子座特異的なタンパク質を免疫沈降する。これを質量分析器で解析することで、転写複合体の時系列変化を同定する。現在までのところ、このような遺伝子座特異的な質量分析は、がん細胞やES細胞、iPS細胞、血球系細胞などでは成功例があるが、分裂能力の低いprimary cultureの細胞では実現されていない。しかし、血管や神経といった高齢化社会の病気の本質となる細胞において、こうした新たな生化学手法を確立させることは、今後の基礎医学、臨床医学の発展に大きな意義があると考えられる。
また、本実験系は、刺激後60分では転写が完全に終結している。これは、血管新生は生理的な条件下では起こりすぎないようにブレーキがかかっている機構の存在を示唆しているが、その実態は分かっていない。平成30年度までは、転写制御に焦点を当てて解析を行ってきたが、最終年度はRNA分解にも着目し、mRNAを分解するタンパク質による血管新生制御解析も行う予定である。
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