2017 Fiscal Year Annual Research Report
ニホンイヌワシの保全を目指した比較ゲノムアプローチ
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17H03624
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
村山 美穂 京都大学, 野生動物研究センター, 教授 (60293552)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中嶋 信美 国立研究開発法人国立環境研究所, 生物・生態系環境研究センター, 室長 (20212087)
福田 智一 岩手大学, 理工学部, 教授 (40321640)
大沼 学 国立研究開発法人国立環境研究所, 生物・生態系環境研究センター, 主任研究員 (50442695)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 大型猛禽類 / ゲノムリシーケンス / 繁殖 / 培養細胞 / 野生動物保全 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ニホンイヌワシは、北半球に広く分布するイヌワシの6亜種のひとつで、国内の推定個体数がわずか500羽と、絶滅が危惧されており、繁殖成績も芳しくない。本研究では、同じく絶滅の危機に陥ったものの、現在は個体数が回復しつつある北ヨーロッパの亜種の調査グループと国際連携し、イヌワシで唯一公開されている北米の亜種のゲノム配列をリファレンスとして、ゲノムリシーケンスを行い、生態学的な差異や、病原体に対する感受性の差異と、ゲノム配列の差異を比較して、関与する遺伝子の機能を解明し、ニホンイヌワシの亜種の特性を明らかにする。さらに、無限分裂細胞株を樹立し、ゲノム解析で明らかになった生理学的機能差を細胞レベルで検証する。加えて、個体ごとの遺伝子型の情報により、飼育や繁殖への貢献を目指す。
本年度は、集団の遺伝的多様性にもとづく個体数予測、ゲノムリシーケンス、獣医学的調査を行い、スコットランドの亜種に関する情報交換を行った。マイクロサテライト多型にもとづいて飼育集団の個体数予測を行い、200年後まで集団の遺伝的多様性が維持される条件を推定した。ニホンイヌワシ2個体について、それぞれHiseqXによる150塩基のペアエンドの全ゲノムのショットガンシーケンスをおこなった。それぞれ約50Gbのデータを取得した。全ゲノム情報にもとづき、数百万年から1万年前の過去の有効集団サイズを推定した。
イヌワシの野生個体群に影響を与える可能性がある感染症として高病原性鳥インフルエンザに着目し、国内の発生状況に関する情報を収集した。また、これまで報告されている鳥インフルエンザウイルスの亜型判定用のプライマーで、国内に侵入するウイルスのタイプ分けが可能か、評価を開始した。
さらに英国スコットランドを訪問して、イヌワシの保全に携わる研究者らと情報交換を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、集団の遺伝的多様性にもとづく個体数予測、ゲノムリシーケンス、獣医学的調査を行い、スコットランドの亜種に関する情報交換を行った。マイクロサテライト多型にもとづいて飼育集団の個体数予測を行い、200年後まで集団の遺伝的多様性が維持される条件を推定した。ニホンイヌワシ2個体について、それぞれHiseqXによる150塩基のペアエンドの全ゲノムのショットガンシーケンスをおこなった。それぞれ約50Gbのデータを取得した。全ゲノム情報にもとづき、数百万年から1万年前の過去の有効集団サイズを推定した。北米のイヌワシの全ゲノムショットガンシークエンスデータを取得し、イヌワシのリファレンス配列にマッピング後、SNPsの情報を取得して、PSMCによる有効集団サイズの歴史的変遷の解析を行った。解析に必要となる1世代あたりの遺伝子突然変異率を9.9x10-9乗、イヌワシの世代時間を飼育下のイヌワシの繁殖記録から25年とした。
解析の結果、北米のイヌワシは100万年前をピークとして減少を続けていたことがわかった。ニホンイヌワシでも同様の解析を行ったところ、10万年前には20万羽が生息していたが、1万年前には5000羽と、個体数が大きく減少したことが推定され、現状の生息数500羽は危機的な状況にあることがうかがえた。
イヌワシの野生個体群に影響を与える可能性がある感染症として高病原性鳥インフルエンザに着目し、国内の発生状況に関する情報を収集した。また、これまで報告されている鳥インフルエンザウイルスの亜型判定用のプライマーで、国内に侵入するウイルスのタイプ分けが可能か、評価を開始した。
さらに英国スコットランドを、村山、大沼が、大学院生とともに訪問して、当地のイヌワシの保全に携わる研究者らと情報交換を行った。以上より、計画は順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
培養細胞の整備と活用については、飼育動物園および野外観察者の協力で、生体の羽軸や皮膚、孵化前死亡胚、死亡個体の組織を採取して初期培養を行い、セルバンカー中で保存する。得られた希少種の培養細胞に、変異型CDK4, Cyclin D, テロメラーゼを導入し、無限分裂を誘導する。２のリシーケンスには高分子DNAが必要であるので、培養細胞および無限分裂化させた培養細胞からのゲノムDNAを使用する。
ゲノムリシーケンスについては、日本とスコットランドの亜種の間で比較を行う。メスのゲノムDNAを抽出し断片化した後、次世代シーケンサー(Illumina, MiSeq)を用いてショットガンで、約2500万配列を得る。このうち約1-5％と推定されるマイクロサテライトを含む配列を削除して、既知の亜種北米イヌワシのゲノム配列をリファレンスにして整列し、SNPを検出する。解析ソフトウェアGenomic Workbenchを用いる。ゲノム配列の比較から、SNPを検出し、北米、北ヨーロッパ、日本の亜種間で、分岐年代や過去の個体数を推定する。
生態・獣医学的調査については、特に深刻な感染症であるトリインフルエンザ、ニューカッスル病、サルモネラ症などの感染状況を、PCR増幅により調査する。今後感染が国内に広がった場合、個体群への深刻な影響が懸念されるウエストナイルウイルスについても遺伝子検査を実施する。
機能遺伝子の検出については、繁殖に関わるメソトシンやアンドロゲンなどのホルモン受容体遺伝子に着目して亜種間で比較し、遺伝子変異との関連についても解析する。
スコットランドから保全ゲノム学や獣医学の研究者を招聘し、国内の研究者とともにセミナーを開催して、情報交換を行う。
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