2018 Fiscal Year Annual Research Report
Analysis of piRNA biogenesis pathway
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17H03632
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
石津 大嗣 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (40574588)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | piRNA / Armitage / RNAサイレンシング / CLIPPARE |
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| Outline of Annual Research Achievements |
piRNAは、相補的な配列を持つ遺伝子の発現を抑制する生殖細胞特異的な機能性小分子RNAである。申請者は、ショウジョウバエを用いたpiRNA生合成因子探索の結果、ATP依存性RNAヘリカーゼであるArmitage（Armi）を同定した。ArmiはpiRNA生合成過程の中間体に結合することを明らかにしたが、その詳細な機能には不明な点が多い。本研究では、これまで詳細な解析がされていなかったpiRNA生合成遷移過程の中間体を捉えるために、Armiが結合するpiRNA中間体の配列解析手法を確立した。また、piRNA生合成に関与する因子群が関与するpiRNA生合成の分子メカニズムの解明を目指した。
これまでの研究から、Armiに結合したpiRNA中間体の5′末端から、24から30番目の塩基をエンドリボヌクレアーゼであるZucchini（Zuc）が切断することにより、成熟型piRNAが生成されるという仮説が立てられている。しかし、CLIP法による解析ではその原理上、Armiが結合している部位は分かるものの、そのRNAの長さや末端配列の情報などは失われてしまう。そのため、ArmiがZucの基質となる最終段階の中間体に結合しているかどうかに関する直接的証明はされていなかった。そこで、従来のCLIP法では失われてしまう5′末端配列を同定する手法であるCLIP followed by parallel analysis of RNA end(CLIPPARE)法を開発し、Armiに結合するRNAの5'末端解析を行った。その結果、ArmiがpiRNA生合成過程の中間体に結合することを明らかにした。また、ArmiのpiRNA中間体への結合は、fs(1)Yb（Yb）タンパク質によって制御されていることを明らかにした。これらの成果をまとめて論文として報告した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
RNA結合タンパク質に結合するRNAの5'末端を解析する新たな手法であるCLIPPARE法の開発に成功し、当初の計画通り、Armi結合RNAの5'末端解析から、ArmiがpiRNA生合成過程の中間体に結合することを明らかにした。さらに、この解析から、これまでpiRNA生合成に関与することが知られていたリボヌクレアーゼであるZucの他に未知のリボヌクレアーゼが関与することが示唆され、piRNA生合成経路の新たなモデルを提唱するに至った。これらの成果を論文として報告することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
CLIPPARE法による解析から、Armiに結合するpiRNA中間体は未知の未知のリボヌクレアーゼによって生成されることが示唆された。これまでの解析からpiRNA中間体はYb bodyと呼ばれる細胞質顆粒構造体で形成されることが示唆されている。Yb bodyに局在化するリボヌクレアーゼを共免疫沈降法などで同定し、それらがpiRNA中間体生成に必須かどうかを検証する。
これまでの解析から、piRNA生合成経路において未知のリボヌクレアーゼによって生成されるpiRNA中間体は、5'末端側がPiwiタンパク質にロードされ、3'末端側をZucが切断することで、成熟型piRNAが形成されると考えられている。ZucをノックダウンしたOSCを用いて、Piwiに対するCLIP法を行うことで、PiwiにpiRNA中間体がロードされることを検証する。
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