2018 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of a tRNA conversion mechanism of transsulfursome by the structural analysis of quaternary complex
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17H03637
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
姚 閔 北海道大学, 先端生命科学研究院, 教授 (40311518)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
尾瀬 農之 北海道大学, 先端生命科学研究院, 准教授 (80380525)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ｃys-tRNA(cys) / transsulfursome / アミルアシルtRNA合成 / 間接合成経路 / Ｘ線結晶構造解析 / クライオ電子顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
古細菌におけるCys-tRNA(Cys) の生合成は，2 つの酵素，SepRS とSepCysS が，それぞれ触媒する２段階の反応から成り立っている．申請者らは，この反応を推進するためには，第3のタンパク質SepCysE がSepRS とSepCysS をつないで3者複合体（transsulfursome）を形成することが必須であることを明らかにした．本研究では，そのtranssulfursome とtRNA から成る４者複合体の構造解析により，transsulfursomeが２つのリンカーを利用して動的なtRNAをプロセスする分子機構を明らかにする．そのために，H29年度に引き続き，H30年度に下記のように研究を進めた．
H30年度に，transsulfursomeとtRNAの結合実験で確認しながら，各反応段階を反映するtranssulfursomeとtRNAの変異体作製を続き，精製できた第１段階反応状態を反映するtranssulfursome変異体SepRS-SepCysE(H)とtRNA複合体を結晶化し，初期結晶を得た．現在に，その結晶の条件最適化を行っている．また，transsulfursome-tRNA複合体のクライオ電子顕微鏡の測定について，当学科に既存の共用透過型電子顕微鏡（Hitachi社製 H7650）を用いて，硝酸ウランを用いたネガティブ染色法によりtranssulfursome-tRNA複合体の確認を行ったところで，tRNA結合状態のtranssulfursomeが単体より，まっすぐのような形が多かったということが分かった．さらに，放射光施設PFにて，凍結条件のスクリーニングを実施した．その結果，transsulfursome-tRNA複合体が沈殿しやすい，クライオ電子顕微鏡の測定に適切なグリッドの作製が困難であることが分かった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年では，各反応段階を反映できるtranssulfursomeとtRNA複合体を得るために，SepRS，SepCysS，SepCysE，tRNAの変異を作製し，目的に応じるtranssulfursome とtRNAの複合体を得ることができた．そのうち，SepRS-SepCysE(H)とtRNA複合体の初期結晶を得た．また，ネガティブ染色法によりtranssulfursome-tRNA複合体の確認を行ったところで，tRNA結合状態のtranssulfursomeが単体より，まっすぐのようなＩ形が多かったということが分かった．さらに，クライオEMの条件のスクリーニングも始め，クライオ電子顕微鏡の測定に適切なグリッドの作製が困難であることが分かり，次に進める計画を立てることができた．
以上の結果から、本研究はおおむねに順調に進展しているといえる．
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの実験結果から、分かった問題を解決しながら，申請当初に計画した実験を実施する．
１．各反応段階を反映する変異体の作製：結晶構造解析とCryo-EMの構造解析を行うために，これまでに得られた実験結果に応じて，大量調製法の条件を最適化しながら，各サンプル（transsulfursome，tRNA，およびそれらの変異体）を調製する．
２．SepRS-SepCysE(H)-tRNA複合体の結晶構造解析：平成30年に引き続き，SepRS-SepCysE(H)-tRNAの結晶化条件を最適化し，Ｘ線回折実験を行い，構造解析へ進める．
３．電顕を用いた各反応状態のtranssulfursome-tRNA複合体の構造解析：平成30年に実施した電顕実験から，ネガティブ染色法により得られたtranssulfursome-tRNA複合体のパーテクルが単独のtranssulfursomeより，I型が多いであることを観察できたので，ネガティブ染色法を用いた単粒子解析法もtranssulfursome-tRNA複合体の構造に適用出来る．よって，今後，Cryo-EMの測定を行うと共に，ネガティブ染色法の解析も進める．また，Cryo-EMの測定はサンプルの安定性を考え，主に国内の電顕施設（大阪大学蛋白質研究所や、放射光施設PF、沖縄科学技術大学院大学など）を利用する．
４．transsulfursomeの動的なtRNAプロセスのメカニズムの検証：各反応状態を示すtranssulfursome-tRNA複合体構造が得られたら，単体と複合体の構造比較を行い，transsulfursomeによって行われる二段階反応における動的なtRNAプロセスを考察する．また，立体構造情報に基づいて活性に密接に関与すると考えられるアミノ酸残基に変異を導入し， tRNAの認識と酵素間の受け渡し機構を明らかにする．
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