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2018 Fiscal Year Annual Research Report

Structural and dynamical basis of taste receptor signaling mechanism

Research Project

Project/Area Number 17H03644
Research InstitutionOkayama University

Principal Investigator

山下 敦子  岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (10321738)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 日下部 裕子  国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品研究部門, ユニット長 (90353937)
Project Period (FY) 2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords味覚受容体
Outline of Annual Research Achievements

味覚受容体T1r2/T1r3に対する各種イオンの作用解析を実施し、亜鉛を含む複数の重金属イオンが、さまざまな動物種由来のT1r2/T1r3の味物質応答を阻害することを確認した。一方、阻害を示さないイオンも存在し、阻害作用が金属種特異的である可能性が示唆された。
これらのイオンの結合部位を同定するため、結晶構造解析可能なメダカT1r2a/T1r3リガンド結合ドメイン(LBD)を用いて、阻害を示したイオン2種、示さなかったイオン2種、応答を引き起こす可能性があるイオン1種の結合状態のX線結晶構造解析を実施し、2.2~3.1 A分解能の回折強度データを得た。得られたデータから、LBDに存在する複数の金属イオン結合部位を同定した。
さらに、これらの結合部位のうち、応答阻害に関わる部位を同定するため、変異体の応答実験を実施した。その結果、受容体の細胞外領域で、LBDよりも下流に存在するシステインリッチドメイン(CRD)に阻害に関与する可能性を示唆する部位を見出した。
CRDも含むT1r2a/T1r3細胞外全領域(ECD)については、これまで得ていた発現量が低かったため、発現コンストラクトの改善を行った結果、精製タグ付加位置の変更により、大幅に発現量を向上させることができ、当該コンストラクトを用いて大量発現系を構築した。
ついで、T1r2a/3ECDの構造動態解析を目的に、一分子蛍光共鳴エネルギー移動解析を行うための試料調製を行ったが、期待される蛍光強度変化を示す試料を得ることができなかった。そこで、蛍光タンパク質を標識として用いる場合の予備解析として、蛍光タンパク質の構造解析および生化学解析を行った。さらに、一分子観察手段として、すでに共同研究で得ていた高速原子間力顕微鏡観察結果を利用することとし、共同研究により分子シミュレーション解析を実施するためのモデル準備を行った。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本課題の目標の1つが、異なる機能状態、特に阻害状態の構造を捉えることであり、H29年度に重金属イオンが味覚受容体に対し阻害効果を示すこと、および低分解能でのメダカT1r2a/T1r3LBD結合結晶構造を得ていた。H30年度の目標として、種々の重金属イオンの阻害効果を確認し、構造解析においては高分解能構造情報を得てLBD結合部位を同定することを計画していたが、これらの研究項目において全て目標を達成した。さらに、同じくH30年度の研究項目としていた変異体解析による部位同定についても、目標を達成し、阻害標的部位候補を見出した。一方で、有望な候補部位として見出された部位が、LBDより下流のCRD領域に見出されたことから、細胞外全領域(ECD)についても構造機能解析を進める必要性があることが判明した。T1r2a/T1r3ECDについては、すでに発現系を構築していたものの、発現量の低さが解析の制限となっていたが、H30年度にコンストラクトを改善することによりこの問題を解決し、大量発現系を構築して、今後の解析準備を整えた。
本課題のもう1つの目標である構造動態解析については、当初予定していた一分子蛍光共鳴エネルギー移動解析のための試料調製が予定通り進まなかったものの、一分子観察結果としてH29年度までに得ていた高速原子間力顕微鏡観察結果を用いて以降の解析を進める計画に変更し、H30年度に共同研究として準備に着手した。
以上から、計画の多くの項目において順調に進展し、一部の項目で当初の予定通り進まなかったものの、計画の変更により目標の達成に向け準備を進めていることから、本課題はおむね順調に進捗していると考える。

Strategy for Future Research Activity

H30年度に引き続き、構造解析条件が確立できているメダカT1r2a/T1r3LBDについて、リガンド非結合状態や阻害剤結合状態を含めた各種条件下での構造解析を実施する。また、受容体応答を示す可能性があるイオンについて、H30年度に得られた結合体の結晶構造データの構造解析を進めるとともに、T1r2a/T1r3LBD試料を用いた各種結合解析を実施する。
加えて、H30年度までの解析で、T1rによる応答やその阻害を考える上で、T1r2a/T1r3ECDを取り扱う重要性が高まったため、H30年度に構築したT1r2a/T1r3ECD大量発現系を基盤に、発現・精製条件の最適化を行い、精製試料を用いた結晶化条件探索を行う。構造解析については、結晶構造解析に加え、得られた精製試料のクライオ電子顕微鏡解析も試行する。構造解析条件が確立できれば、すでに見出している阻害作用を示す重金属イオンも含め、受容体機能を制御する各種リガンド存在下での構造解析を実施する。さらに、T1rECDを用いて、蛍光タンパク質融合体などを用いた蛍光共鳴エネルギー移動解析系を構築し、味物質や阻害剤結合条件下での構造変化の解析を行う。加えて、引き続き全長受容体を用いた応答解析を実施し、変異体解析などを通して阻害部位をはじめとする受容体機能調節部位の同定を行う。
これらの解析で得られた結果と、H30年度より共同研究により実施しているMDシミュレーションの結果を統合し、T1r細胞外領域の構造変化がシグナル伝達を引き起こすメカニズムについて考察する。

  • Research Products

    (16 results)

All 2019 2018

All Journal Article (4 results) (of which Int'l Joint Research: 1 results,  Peer Reviewed: 3 results,  Open Access: 2 results) Presentation (12 results) (of which Int'l Joint Research: 3 results,  Invited: 5 results)

  • [Journal Article] Specific modification at the C-terminal lysine residue of the green fluorescent protein variant, GFPuv, expressed in Escherichia coli2019

    • Author(s)
      Takahiro Nakatani, Norihisa Yasui, Issei Tamura & Atsuko Yamashita
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 9 Pages: 4722

    • DOI

      10.1038/s41598-019-41309-8

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Journal Article] 食行動と栄養摂取をむすぶ味覚受容体による味分子認識2019

    • Author(s)
      山下敦子
    • Journal Title

      実験医学

      Volume: 37 Pages: 531-535

  • [Journal Article] うま味受容体細胞外リガンド結合ドメインのX線結晶構造解析2019

    • Author(s)
      細谷 麻以子, 山下 敦子
    • Journal Title

      SPring-8/SACLA利用研究成果集

      Volume: 7 Pages: NA

    • DOI

      10.189567/rr.7.1.37

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Structure-Function Relationships of Olfactory and Taste Receptors2018

    • Author(s)
      Behrens Maik、Briand Loic、de March Claire A、Matsunami Hiroaki、Yamashita Atsuko、Meyerhof Wolfgang、Weyand Simone
    • Journal Title

      Chemical Senses

      Volume: 43 Pages: 81~87

    • DOI

      10.1093/chemse/bjx083

    • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
  • [Presentation] 味覚受容体T1R2/T1R3の甘味物質応答に対する亜鉛イオンの作用2019

    • Author(s)
      喜多志保子, 日下部裕子, 山下敦子
    • Organizer
      日本薬学会第139年会
  • [Presentation] Structural basis of amino acid-perception by T1r taste receptors2019

    • Author(s)
      Atsuko Yamashita
    • Organizer
      The 9th Federation of Asian and Oceanian Physiological Societies Congress (FAOPS2019) in conjunction with the 96th Annual Meeting of the Physiological Society of Japan
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] Amino acid-binding characteristics of the ligand-binding domains of taste receptors analyzed by thermal shift assay2019

    • Author(s)
      Takashi Yoshida, Norihisa Yasui, Atsuko Yamashita
    • Organizer
      The 1st International Symposium on Chemical Communication (ISCC2019)
    • Int'l Joint Research
  • [Presentation] Taste perception approached by biophysics and structural biology2018

    • Author(s)
      Atsuko Yamashita
    • Organizer
      第56回日本生物物理学会年会
    • Invited
  • [Presentation] Structural basis for recognition of preferable taste substances by T1r taste receptors2018

    • Author(s)
      Atsuko Yamashita
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会年会
    • Invited
  • [Presentation] サーマルシフトアッセイによる味覚受容体細胞外領域に対するアミノ酸の結合解析2018

    • Author(s)
      吉田 高志, 安井 典久, 渥美 菜奈子, 山下 敦子
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会年会
  • [Presentation] 表面プラズモン共鳴法による味覚受容体T1R細胞内C末端領域とカルシウム結合タンパク質の相互作用の速度論的解析2018

    • Author(s)
      吉田 涼希, 安井 典久, 山下 敦子
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会年会
  • [Presentation] 分子骨格として一本鎖モネリンを用いたGFPを標的とする人工結合タンパク質の作製とその分子特性解析2018

    • Author(s)
      安井 典久, 山下 敦子
    • Organizer
      第41回日本分子生物学会年会
  • [Presentation] Protein thermal shift assay indicated a broad amino acid-binding capability of the ligand-binding domains of fish T1r taste receptor2018

    • Author(s)
      Takashi Yoshida, Norihisa Yasui, Nanako Atsumi, Yuko Kusakabe, Atsuko Yamashita
    • Organizer
      The 17th International Symposium on Molecular and Neural Mechanisms of Taste and Olfactory Perception (ISMNTOP2018)
    • Int'l Joint Research / Invited
  • [Presentation] 味覚受容体による味物質応答の相関構造解析2018

    • Author(s)
      山下敦子
    • Organizer
      平成30年度第1回構造生物学研究会
    • Invited
  • [Presentation] 一本鎖モネリンを分子骨格とする人工結合タンパク質ファージディスプレイライブラリーの構築2018

    • Author(s)
      安井典久,山下敦子
    • Organizer
      第18回日本蛋白質科学会年会
  • [Presentation] 味物質-味覚受容体の構造生物学研究による化学コミュニケーションの理解2018

    • Author(s)
      山下敦子
    • Organizer
      新学術領域研究(研究領域提案型) 「化学コミュニケーションのフロンティア」

URL: 

Published: 2019-12-27  

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