2017 Fiscal Year Annual Research Report
液胞型 ATPase の全体構造決定を突破口とした回転プロトン輸送機構の解明
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17H03648
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| Research Institution | Kyoto Sangyo University |
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Principal Investigator |
横山 謙 京都産業大学, 総合生命科学部, 教授 (70271377)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
光岡 薫 大阪大学, 超高圧電子顕微鏡センター, 教授 (60301230)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ATP合成酵素 / V-ATPase / bioenergetics / cryoEM |
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| Outline of Annual Research Achievements |
V-ATPase は、真核生物の酸性小胞（リソゾーム、エンドソームなど）に存在するATP駆動性のプロトンポンプであり、小胞内の酸性化を通して、タンパク質の品質管理や物質代謝を担っている。ATP合成酵素FoF1 と同様の回転触媒機構で ATPのエネルギーを回転力に変えてプロトンを輸送する。低温電子顕微鏡（クライオEM） による単粒子解析は、タンパク質の構造を決定する有力な方法の１つである。電子直接検出器の登場および解析手法の発展により、タンパク質分子を時には原子分解能で構造決定することが可能になった。我々は、良好なクライオ電顕画像を得るために、クライオグリッドの作製条件を検討し、その結果、LMNGという界面活性剤で可溶化することで S/N比が良い画像が得られた。このグリッドから、大阪大学高圧電顕センターにある自動撮影装置を備えた Titan Krios (FEI)により、V-ATPaseの単粒子画像を5000枚程度撮影した。そこから V-ATPase の単粒子画像を構造解析ソフト RELIONにより抽出した。最終的に20万を超える単粒子画像を解析することで、３つの回転状態に相当する立体構造を得た。構造精密化により、１状態に関して 約5A 分解能でモデルを組み立てることができた。その結果、回転に伴う外周固定子部分の動き、V1部分にADPが２分子結合し、ADP阻害状態になっていること、プロトンが透過する親水的な通り道が同定された。研究成果を Nature Communications に投稿し、受理された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、VoV1 の安定化条件および可溶化条件を検討し、ほぼ界面活性剤が存在しない溶液条件で、VoV1のクライオグリッドを複数条件で作製した。LMNG は、限界ミセル濃度以下でも膜タンパク質の可溶化状態を維持できるので、溶液中の濃度をほぼゼロにしても VoV1 を可溶化することが可能である。LMNGがほとんどない VoV1 溶液でクライオグリッドを作製し、クライオ電顕画像を撮影したところ、S/N比が良い画像が得られた。ただし、氷厚調整が難しく、良いクライオグリッドを調製できるのは稀で、今後改善が必要である。氷厚が最適化されたクライオグリッドから得られたクライオ画像から VoV1の単粒子画像を画像解析ソフト RELIONで抽出した。1枚のクライオ画像から200程度の単粒子像が得られれば、それは良いクライオグリッドといえる。自動撮影により、数千枚のクライオ画像を撮影し、最終的に50万以上の単粒子画像を得た。目視および2次元クラス分けでよくない単粒子画像を除き、3次元クラス分けを行った。当初8クラス設定では、二種類のクラスしか得られなかったが、12クラス設定でクラス分けすると、中心回転軸の向きが異なる3つの構造が得られた。 VoV1 は ATP結合部位を3つ持ち、三種類の異なる回転中間体が予想されるが、得られた構造は、この回転状態に対応すると考えられる。分解能を上げるために構造精密化および溶媒の密度を引き算する Post Process という操作により 6A 程度の分解能の構造を得た。この時点での単粒子数がクラスあたり最大で 8万程度であった。さらに分解能を上げるために、クライオ電顕画像の撮影を進め、抽出できる単粒子画像数を増やし、最終的に20万程度にしたところ、5 A 台の分解能の構造を得ることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
分解能を上げるために、解析法を工夫する。現在 RELION 2.1 で解析を進めているが、新しくリリースされたRELION 3.0 での解析を進める。動画補正するプログラムの精度が上がっているので、粒子の動きによる分解能の低下を軽減することが期待される。また、GPUをつかった並列計算がより洗練されており、計算にかかる時間が劇的に減ることが期待される。分解能があがらない原因として、Voと V1 間での分子動きが考えられる。たとえば、Vo部分に対して V1部分が複数の立体構造をとっていれば、全体の分解能は悪くなる。この問題を解決するために、Voもしくは V1部分だけに焦点をあて、その他の部分を無視して解析を進める方法がある（Focused classification）。実際、V1部分の方が部分分解能が高いので、この方法でそれぞれの部分の分解能を上げることが可能であると考える。解析の他に、粒子数を増やすのも重要である。良好なグリッド作製の再現性が悪いため、より簡単に良いグリッドが得られる条件を探す。具体的には、界面活性剤がまったくない状態にすることができるナノディスクによる可溶化や、LMNG以上に吸着力が強い、GDNといった新しく開発された界面活性剤を試してみる。良いグリッドができる歩留まりを上げることで、良い単粒子画像を100万単位で抽出し、Focused classification で分類し、より単一な構造に分けることで分解能を上げる。
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