2017 Fiscal Year Annual Research Report
High temporal resolution single-molecule analysis of the mechanochemical coupling of kinesin
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17H03661
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| Research Institution | Aoyama Gakuin University |
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Principal Investigator |
富重 道雄 青山学院大学, 理工学部, 教授 (50361530)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 分子モーター / 生物物理 / １分子計測（SMD） / ナノマシン / 細胞内輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、微小管上を運動する分子モーターキネシンがATP加水分解によって得られたエネルギーを一方向性の運動や力発生に変換する仕組みを明らかにすることを目標にする。本年度はキネシンが一方向性を示す仕組みを明らかにするための研究を行った。ステップを引き起こすモデルとして、拡散運動にバイアスがかかるというモデルと前後の結合部位への結合のしやすさにバイアスがかかるという二つのモデルが提案されている。これらのモデルを検証するために、２つの仕組みを交互に使いながら二足歩行運動するタンデム変異体を用いて、それぞれの頭部を金コロイド粒子で標識し、全反射照明型暗視野顕微鏡を用いて50マイクロ秒の時間分解能で観察を行った。その結果、結合バイアスのみでのステップの場合は、90%以上の確率で前方ステップするが、拡散バイアスのみでのステップの場合は、50%程度の確率で後ろの結合部位に再結合し、ATP濃度を下げるとその確率が上昇することが明らかになった。これらの結果は、前方ステップには拡散バイアスの仕組みのみで十分であることを示唆するものである。一方、微小管から解離した後、再び結合するまでの時間は、いずれも3ミリ秒程度で顕著な違いは見られなかった。次に、微小管から解離して再結合するまでの速度定数を決める要因を調べるために、片頭部の微小管への結合解離の高速一分子観察を行った。片頭部をコイルドコイルストークを介して微小管に結合した後解離しにくい変異体頭部につなぐことで微小管に繋留する実験系を確立した。野生型頭部を金コロイドで標識し、高速一分子計測法で運動を観察したところ、片頭部が微小管から解離している時間はATP濃度によらず3ミリ秒程度であることがわかった。この結果は、微小管から解離している時間は、浮いている頭部自身の何らかの構造遷移に依存していることを示すものである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度４月に研究代表者が青山学院大学に異動したため、研究室の引っ越し・立ち上げを終えて、本研究で使用する高速暗視野顕微鏡のセットアップを完了するのに７月末まで時間を要した。しかしその後は顕微鏡装置が研究目的に対して十分な性能を発揮し、片頭部のキネシンの結合解離を高時間分解能で計測する新しい実験系を確立するなど、順調に研究が進んだ。
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| Strategy for Future Research Activity |
キネシンが二足歩行運動する際に、前頭部よりも先に後ろ頭部が微小管から解離する仕組みを明らかにするために、後ろ頭部が微小管から解離しにくい変異体ヘテロダイマーを用いて、前頭部の微小管からの結合解離を高速暗視野顕微鏡を用いて観察する。また本年度実施した、拡散バイアスと結合バイアスを交互に使って運動する変異体キネシンの高速一分子観察を引き続き行うことで、キネシンのステップを引き起こす仕組みの詳細を明らかにする。
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