2018 Fiscal Year Annual Research Report
Establishment of Theoretical Method of Predicting Thermostabilizing Mutations for Membrane Proteins
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17H03663
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
木下 正弘 京都大学, エネルギー理工学研究所, 教授 (90195339)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 膜蛋白質 / アミノ酸置換 / 耐熱化 / G蛋白質共役型受容体 / ロドプシン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（１）G蛋白質共役型受容体(GPCR)の耐熱化に繋がるアミノ酸置換の理論的同定法の確立に向けて我々が開発した自由エネルギー関数は，現在までにクラスAの不活性型の安定化において多くの成果を挙げてきたが，活性型に対してはまだ実績が無かった。自由エネルギー関数の活性型への適用性を調べるため，A2aRの野生型と試行錯誤的に他の研究グループが得た安定化4置換体の活性型に対し，後者の方が確かに安定であることを示せた。上記自由エネルギー関数が活性型にも適用できることが分かった。
（２）上記の理論的同定法をGPCR以外の一般の膜蛋白質にも適用できるように拡張した。膜内部位のみならず水中部位をも含めた新しい自由エネルギー関数を構築した。TR (thermophilic rhodopsin)は膜蛋白質としては例外的に高い熱安定性を持つ。TRとXR (xanthorhodopsin)は高いアミノ酸配列相同性と立体構造の類似性を有するにも拘わらず，TRの熱安定性はXRのそれよりも遥かに高い。新しい自由エネルギー関数を用いて，TRの方が遥かに安定であることを示すと共に，そのような違いが生じる物理要因を特定することが出来た。
（３）GPCRのように本来安定性の低い膜蛋白質の安定化と異なり，TRのようにアミノ酸配列がほぼ最適化された膜蛋白質を本来の機能を保持させつつ安定化することは非常に難しいと考えられる。後者に対して有効と考えられる別の耐熱化アミノ酸置換の理論的同定法を考え，それをTRに適用することにより，機能を保持させつつより安定にする単置換を1つ発見した。今後，多重置換を用いてさらなる安定化が実現できれば，TRを新しい高機能性材料として使用できるものと期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
耐熱化に繋がるアミノ酸置換の我々の理論的同定法が，GPCRの不活性型のみならずGPCRの活性型や広く一般の膜蛋白質にも適用できるように拡張できた。特に，それを用いてTRのさらなる耐熱化を本来の機能を保持させつつ実現できたことは注目に値する。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）Class Aの活性型A2aR（GPCRの一種）に対し，耐熱化に繋がるアミノ酸置換をすでに理論的に予測しているが，それらによって実際に耐熱化が得られるか否かを実験で確認する。
（２）あらゆる膜蛋白質に対して，糖やアルコールなどの共溶媒の添加が熱安定性に及ぼす影響を調べる。理論解析によって，水溶性蛋白質の場合と同様に，スクロース①・グルコース②・マニトール③・エリスリトール④・グリセロール⑤の添加は安定化向上に繋がり，その強さは①>②~③>④>⑤の順番に従い，プロパノールの添加は安定化低下をもたらすことを予言している。TRとGPCRの一種であるA2aRに対して，このことを実験で確認する。
（３）RxRとHsBR（いずれもロドプシンに属する）はアミノ酸配列が似ているにも拘わらず，RxRの方が遥かに熱安定性が高い。本研究でRxRの結晶構造を初めて解いたが，驚いたことに，HsBRと視覚的にほとんど同じ立体構造であった。こうしたことは膜蛋白質でしばしば見られる。熱安定性を議論できるのは熱力学である。立体構造という幾何学的特性と熱力学をどのように結びつけるかは，生化学における未解決の重要課題である。各原子のx-y-z座標と力場パラメータのみから熱安定性を評価できる方法論を構築し，RxRとHsBRなる顕著な例に適用してその有効性を実証する。
（４）（１）および（３）で用いる理論は類似している。理論解析結果と実験結果が合わない場合には理論の改良を行う。（２）で用いる理論はこれらとは別のものである。やはり，理論解析結果と実験結果が合わない場合には理論の改良を行う。
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[Journal Article] Ligand Binding to Human Prostaglandin E Receptor EP4 at the Lipid-Bilayer Interface2018
Author(s)
Y. Toyoda, K. Morimoto, R. Suno, S. Horita, K. Yamashita, K. Hirata, Y. Sekiguchi, S. Yasuda, M. Shiroishi, T. Shimizu, Y. Urushibata, Y. Kajiwara, ....., T. Hirokawa, M. Kinoshita, T. Murata, K. Takayama, M. Yamamoto, S. Narumiya, S. Iwata, T. Kobayashi
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Journal Title
Nature Chemical Biology
Volume: 15
Pages: 18-26
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Structural Insights into the Subtype Selective Antagonist Binding to the M2 Muscarinic Receptor2018
Author(s)
R. Suno, S. Lee, S. Maeda, S. Yasuda, K. Yamashita, K. Hirata, S. Horita, M.S. Tawaramoto, H. Tsujimoto, T. Murata, M. Kinoshita, N. Vaidehi, M. Yamamoto, B. K. Kobilka, S. Iwata, T. Kobayashi
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Journal Title
Nature Chemical Biology
Volume: 14
Pages: 1150-1158
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Identification of thermostabilizing mutations for G-protein coupled receptors: Rapid method based on statistical thermodynamics2018
Author(s)
S. Yasuda, Y. Kajiwara, Y. Takamuku, N. Suzuki, Y. Toyoda, K. Morimoto, R. Suno, S. Iwata, T. Kobayashi, T. Murata, M. Kinoshita
Organizer
ImPACT野地プログラム国際シンポジウム“Artificial Cell Reactor Science and Technology”
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