2018 Fiscal Year Annual Research Report

Mechanism of contraction and backflow prevention by check valves in ABC transporter pump

Research Project

Project/Area Number	17H03664
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	加藤博章京都大学, 薬学研究科, 教授 (90204487)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	中津亨京都大学, 薬学研究科, 准教授 (50293949) 山口知宏京都大学, 薬学研究科, 助教 (80346791) 宮ノ入洋平大阪大学, 蛋白質研究所, 准教授 (80547521)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	構造生物学 / トランスポーター / ATP / 膜タンパク質 / X線 / 多剤耐性
Outline of Annual Research Achievements	温泉に棲む好熱性真核生物Cyanidioschyzon merolae由来のP糖タンパク質であるCmABCB1の優れた結晶化能を利用して、同一分子の内向型と外向型の両立体配座の構造を初めて結晶化することに成功した。この結晶化によって、ヌクレオチドと結合した外向型構造がABCトランスポーターとしては最良の分解能である1.9オングストロームで明らかとなった。用いた変異型CmABCB1は、野生型とよく似た基質輸送活性とATP加水分解活性を示したことから、変異導入による構造への影響はほとんどないものと推定された。ポンプ機能に関わるアミノ酸残基として、新たにTrp400が見つかった。Trp400をTyrに置換すると輸送基質ローダミンに対する排出活性が著しく低下したが、他の輸送基質に対しては影響がなく、ローダミン特異的な何らかの機能を有するアミノ残残基であることが明らかとなった。また、NMRによる解析の標的であるTrp残基の構造状態を蛍光スペクトルによって分析する手法を確立した。そこで、基質輸送の経路となっている部位を結晶構造解析の結果から予測して、新たにTrp残基を導入したところ、基質結合に伴い、蛍光強度の大幅な消光が観測されたことから、基質結合を蛍光分析によって観測することが可能となった。新たに立体構造が明らかになった変異型CmABCB1を用いて分子動力学計算による立体構造変化のシミュレーションを行った。また、多種類の基質を用いた場合の輸送過程についてもシミュレーションを行った。その結果、Trp蛍光分析によって明らかとなったアミノ酸残基がその経路上に位置することが判明した。さらに、前年度合成に成功したローダミン誘導体RT-17との複合体の結晶化に成功した。得られた結晶をX線解析に供した結果、CmABCB1の膜貫通領域の中央の内腔にRT-17と思われる電子密度を観測することができた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 本研究では、方法論の異なる５つの研究手法を協奏的に用いてABCトランスポーターメカニズムに迫ろうとする点が革新的であり、また、前例のない成果が得られつつある。特に、Nature Communicationに発表した同一分子における異なる２つの立体配座の高分解能での結晶構造決定の成果は、ABCトランスポーターのメカニズムの基盤でとなる交互アクセスモデルを構成する２つの状態すなわち内向型と外向型状態の立体構造であり、研究コミュニティが長らく待ち焦がれたそれぞれの立体構造と詳細な構造変化の情報を提供したものとなった。一方、NMR解析においては、15Nラベル化体の供給に問題が生じTrp残基の構造変化を指標とする動的構造解析が遅れている。しかし、Trp残基の蛍光特性を生かし、蛍光スペクトル分析に変更したところ、基質結合部位を検出することに成功した。また、この結果は、独立に行ってきた分子動力学計算を用いたシミュレーションの結果とも整合したことから、新たな成果に結びつきつつある。さらに、合成した新規阻害剤との複合体の結晶も得られたことから、今後さらなる大きな成果が期待されることとなった。
Strategy for Future Research Activity	阻害剤との複合体のX線結晶解析、変異体の機能解析と、結晶解析用の大量試料の調製、MD計算、有機合成は、当初の計画通り順調に進んでおり、今後とも順調に進むものと考えられる。一方、NMR解析においては、試料調製の再現性に問題が生じたが、培地の再検討と菌株の培地への順応を達成することにより新たな培養方法が見つかり、15Nラベル化体を安定供給することが可能となった。さらに、NMRの実験を補完目的で行った蛍光スペクトルを用いた立体構造変化の補足実験から、基質結合を検出できる新たな計測系を確立することができている。今後は、これら成果を活用して当初の目的だったポンプ収縮弛緩と逆止弁メカニズムの解明を達成できるものと思われるだけでなく、基質排出ゲートの開閉制御のメカニズムの解明についても期待できる状況が生じている。