2018 Fiscal Year Annual Research Report
変異チューブリンによる重合―GTP加水分解の共役メカニズムの解明
| Project/Area Number |
17H03668
|
|---|
| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
|---|
Principal Investigator |
武藤 悦子 国立研究開発法人理化学研究所, 脳神経科学研究センター, チームリーダー (90373373)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
今井 洋 大阪大学, 理学研究科, 助教 (60391869)
上村 慎治 中央大学, 理工学部, 教授 (90177585)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 微小管 / GTPチューブリン / 核生成 / 重合キネティクス / ネガティブ染色電子顕微鏡法 / 臨界核 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
微小管の重合・脱重合はGTPの結合や加水分解によって制御され、細胞の形態維持や変形、染色体分裂などにとって重要な役割を果たしている。本研究は、GTP 加水分解と重合の共役メカニズムを解明することを目的とする。1990年代の研究からは、チューブリンはGTPの結合に伴い、曲率の高いcurvedの構造から曲率の低いstraightな構造へと変化していることが予想されるが、これまでの実験ではそのような構造変化は検出されず、微小管研究者の間では最大の謎とされてきた。最近では、Riceらによって「チューブリンの構造変化を誘導しているのは、GTPではなく、微小管のラティスである」とする、ラティスモデルも提案されている(Rice et al., 2008, PNAS)。
我々は、ラピッドフラッシュネガティブ染色電子顕微鏡法により、GTP存在下重合初期に出現する構造中間体（oligomer)を、GDP存在下に出現するoligomerと比較することにより、GTP存在下に限りごく少数のStraight oligomerが作られていることを見出した。さらに、βチューブリンのGTP結合サイトに特定の変異を加えると、Straight oligomerの出現頻度が増大し、それに伴い微小管の核生成の加速、臨界濃度の減少が起こることを見出した。これらの結果の分析から、GTPはアロステリックエフェクターとして直接チューブリンのcurved → straight への構造変化を制御していること、少数のstraight oligomerはやがて微小管の核となることが明らかになった。Straightなオリゴマーは、重合初期に一過的かつごく少数しか作られないため、これまでの測定では見落とされてきたが、我々は、複数の技術を組み合わせた新しいアプローチにより長年の謎を解決した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
我々のグループは2013年、昆虫細胞とバキュロウイルスを組み合わせた実験系で、ヒトの組み換え体チューブリンの発現・精製に成功した(Minoura et al., 2013, FEBS Lett.)。さらにこの実験系を応用して、本研究では、ショウジョウバエの組み換え体チューブリンを発現させ、結晶構造解析の結果(Nawrotek et al., 2011, J. Mol. Biol.)を参考に、微小管の重合に重要なGTP結合サイトの近傍に変異を導入した２種類のミュータントを作成した（それぞれタイプ１、タイプ２と命名）。結晶構造解析の結果、タイプ１とタイプ２の変異はβチューブリンのT5ループの構造ゆらぎに反対方向の効果をもたらしていることが明らかになった。タイプ１では野生型に比べ核生成が加速し、重合反応が平衡に達した時の臨界濃度が低下、タイプ２では逆に核生成速度が低下し、臨界濃度が増えていた。さらに核生成時に現われるチューブリンオリゴマーの曲率を調べると、タイプ1では野生型に比べ著しくオリゴマーの曲率が減少していたのに対し、タイプ２では野生型に比べ曲率は高めであった。以上の結果に基づき、「GTP結合によるT5ループの構造変化 → 曲率の低いオリゴマーの生成 → 重合核」という、核生成の構造パスウェイを明らかにすることができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
まず、これまで構造パスウェイについて我々が得た知見を、論文として発表する。一方、上記構造パスウェイにおいて、臨界核サイズを超えたオリゴマーは、どのように微小管に成長していくのか、明らかにしたい。そのため、重合キネティクスを元に臨界核サイズを計算する。一方で、核生成時に出現する全てのダイマー、オリゴマーの長さと曲率を実測する。両者を照らしあわせることで、GTP-チューブリンが核生成に必要なエネルギー障壁を、いかにして乗り越えるのか、解明を目指す。In vitroにおけるSpontaneous nucleationの分子機構を明らかにすることで、細胞内の微小管生成の仕組みの理解につなげたい。
|
-
-
-
[Presentation] 微小管のX線繊維回折：チューブリン格子ラセン角の計測2019
Author(s)
上村慎治, 今井洋, 八木俊樹, 岩本裕之, Estevez-Galego, J., Lucena-Agell, D., Diaz, J.-F. & Hermida-Merino, D.
Organizer
2019年生体運動合同班会議
-
-
-
-
