2018 Fiscal Year Annual Research Report
Intercellular recognition between sperm and eggs: Studies on the allogeneic and xenogeneic molecular recognition
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17H03672
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
澤田 均 名古屋大学, 理学研究科, 教授 (60158946)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ホヤ / 受精 / 自家不和合性 / 精子 / 卵 / 昆虫細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
当研究室では、カタユウレイボヤを用いたポジショナルクローニング、卵黄膜プロテオーム解析、ゲノム編集による機能解析を行い、精子側因子s-Themis-A, s-Themis-B, s-Themis-B2および卵側因子v-Themis-A, v-Themis-B, v-Themis-B2が自己非自己細胞認識に関わることを明らかにしている。しかし、s-Themisとv-Themisのタンパク質レベルの相互作用は確認されていない。そこで今回、糖鎖修飾等が可能な昆虫細胞S2での発現系を用い、s-Themis-Bとv-Themis-Bの発現系構築とタンパク質間相互作用に関する検討を行った。
まず、v-Themis-Bとs-Themis-BのcDNAクローニングを行った。アレルは082、JGIの２つを用いた。v-Themis-Bに関してはN末側のシグナル配列を除いた全長とC末端にGFP tagを付けたもの、またs-Themis-Bに関しては、シグナル配列の直後から、超可変領域の後まで(Δ1)、REJドメインの後まで(Δ2）、細胞外領域まで(Δ3）という３種類のコンストラクトを作製した。各コンストラクトのN末端には分泌シグナルBiPを、C末側にはV5 tagを付加した。これらをS２細胞に遺伝子導入し、培養上清を回収して、抗V5抗体を用いたウエスタンブロット解析により発現と相互作用解析を行った。本実験により、s/v-ThemisのS2細胞での発現に初めて成功したが、タンパク質間相互作用を解析するには量的に不十分であったので、2019年度は大量発現させる条件を検討する。また、s/v-Themis-Bのみならず、s/v-Themis-B2やs/v-Themis-Aに関してもハプロタイプ特異的相互作用を解析する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今まで、昆虫細胞S2での発現に関しては成功していなかったが、今回条件を検討し、培養液中に分泌されるタンパク質を確認することができた。しかし、タンパク質間相互作用を解析するには量的に不十分なので今後は大量発現条件を確立することが課題である。しかし、総合的にみて順調に進んでいると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、s/v-Themis-BをS２細胞で大量発現させる条件を検討する。また、s/v-Themis-Bのみならず、s/v-Themis-B2やs/v-Themis-Aに関してもハプロタイプ特異的相互作用を解析する。
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Research Products
(13 results)
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[Journal Article] Chitin-based barrier immunity and Its loss predated mucus-colonization by indigenous gut microbiota.2018
Author(s)
Nakashima, K., Kimura, S., Ogawa, Y., Watanabe, S., Soma, S., Kaneko, T., Yamada, L., Sawada, H., Tung, C.-H., Lu, T-M., Yu, J-K., Briones, A. V., Kikuchi, S., and Satoh, N.
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Journal Title
Nature Communications
Volume: 9(1)
Pages: 3402
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] The male gamete membrane protein DMP9/DAU2 is required for double fertilization in flowering plants.2018
Author(s)
Takahashi T., Mori, T., Ueda, K., Yamada, L., Nagahara, S., Higashiyama, T., Sawada, H., Igawa, T.
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Journal Title
Development
Volume: 145(23)
Pages: dev170076.
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Dual gene repertories for larval and adult shells reveal molecules for molluscan shell formation.2018
Author(s)
Zhao, R., Takeuchi, T., Luo, Y-J., Ishikawa, A., Kobayashi, T., Koyanagi, R., Villar-Briones, A., Yamada, L., Sawada, H., Iwanaga, S., Nagai, K., Satoh, N., and Endo, K.
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Journal Title
Molecular Biology and Evolution,
Volume: 35(11)
Pages: 2751-2761
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Journal Article] Vitelline membrane proteins promote left-sided nodal expression after neurula rotation in the ascidian, Halocynthia roretzi.2018
Author(s)
Tanaka, Y., Yamada, S., Connop, S. L., Hashii, N., Sawada, H., Shih, Y., and Nishida, H.
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Journal Title
Developmental Biology
Volume: 449(1)
Pages: 52-61
DOI
Peer Reviewed
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