2017 Fiscal Year Annual Research Report
Functional analysis of sphingosine-1-phosphate in hematopoietic development using genome editing technologies
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17H03681
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
川原 敦雄 山梨大学, 大学院総合研究部, 教授 (10362518)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | スフィンゴシン-1-リン酸 / スフィンゴシンキナーゼ / S1P受容体 / spns2 / ゲノム編集技術 / CRISPR/Cas9 / 形態形成 / ゼブラフィッシュ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
脂質メディエーターであるスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)は、細胞内に局在するスフィンゴシンキナーゼ(Sphk1, 2)によるスフィンゴシンのリン酸化により生成される。S1P受容体(S1PR)は無脊椎動物のゲノムには見つかっていないので、脊椎動物への進化の過程で多様な生理活性を獲得したと考えられる。S1Pは、哺乳類ではリンパ球の再循環を調節していることが知られている。我々は、心臓発生に異常を示すゼブラフィッシュ変異体の原因遺伝子としてS1P輸送体Spns2を発見し、新規の生理機能としてS1Pシグナルが心臓前駆細胞の移動を制御していることを明らかにした。
ヒトでは、S1Pと癌や自己免疫疾患との関連性が指摘されており、S1Pの生理機能の解明は、上記の難治性疾患の理解につながる可能性がある。Sphk1, 2二重欠損マウスやspns2およびs1pr2ゼブラフィッシュ変異体は発生致死であるので、形態形成におけるS1Pの役割は不明な点が多い。本研究は、S1Pの新しい生理機能をS1PR機能欠損ゼブラフィッシュ変異体の表現型解析から解明することを目的としている。我々は、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9を用い全てのS1PR変異体の作成に成功している。それらの表現型解析からs1pr2変異体が二叉心臓の表現型を示すことが明らかになっているが、それ以外のS1PRを単独で破壊した場合には(s1pr1, s1pr3a, s1pr3b, s1pr4, s1pr5a, s1pr5b変異体)、顕著な発生異常は認められておらず、S1PR間で機能的に補完している可能性も考えられた。本研究では、S1PRに対する多重遺伝子破壊系統を作成し、S1Pシグナルの形態形成における役割を明らかにする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、脂質メディエーターであるスフィンゴシン-1-リン酸(S1P)の生理機能を、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9で作成したS1P受容体(S1PR)機能欠損ゼブラフィッシュ変異体の表現型解析から明らかにすることである。初期発生における発現動態をwhole-mount in situ hybridization法で解析した結果、s1pr1は神経細胞に、s1pr2は心臓前駆細胞・中脳後脳境界部に、s1pr3aは眼のレンズに、s1pr3bは三叉神経節に、s1pr5aは体節、s1pr5bは血島(intermediate cell mass)での発現と特徴的な組織特異的な発現を示すことが明らかになっている。
我々は、ゲノム編集技術CRISPR/Cas9を用いS1P合成酵素(sphk1, 2)および全てのS1P受容体(s1pr1-s1pr5b)に対する機能欠損ゼブラフィッシュ変異体を作成した。sphk2変異体とs1pr2変異体が二叉心臓を伴う胚性致死の表現型を示したが、それ以外の変異体は初期発生過程に顕著な異常が認められなかった。そこで、S1PR二重変異体を樹立し表現型解析を行った結果、s1pr3b-s1pr4二重変異体が４日胚において血液細胞の数が減少することが観察された。
ゼブラフィッシュの造血発生は、一次造血(血島)から二次造血(後部静脈叢・腎臓)へと移行する。血液細胞の分化過程に関して化学染色法を用いて解析した結果、成熟した赤血球と好中球を示す染色が弱いことが明らかとなった。s1pr3b-s1pr4二重変異体胚は、発生過程で血液細胞の数が減ってはいたが成魚まで生育できる個体が得られている。これらの結果は、他のS1PRによる機能の補完が生じている可能性も考えられ、s1pr3b-s1pr4二重変異体を基盤としたS1PR多重変異体の作成を計画している。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では、S1PR機能欠損ゼブラフィッシュの表現型解析からS1Pの新しい生理機能を明らかにすることを目標としている。s1pr3b-s1pr4二重変異体において血液細胞の数が減少することが観察されたが、少数の胚が成魚まで生育できたので、別のS1PRによる機能補完の可能性も考えられた。そこで、s1pr3b-s1pr4二重変異体を基盤としたS1PR多重変異体を作成し、表現型解析を遂行する。
血液細胞の分化過程では、造血幹細胞から赤血球・リンパ球・ミエロイド系細胞などに分化・成熟していくので、各細胞系譜への分化過程を可視化できるトランスジェニック系統と交配し、バイオイメージングによる細胞動態を解析する。さらに、造血発生のマーカー遺伝子の発現動態をwhole-mount in situ hybridization法やリアルタイムPCR法で解析する。特に、造血幹細胞の移動、血液細胞の分化過程、微小環境(ニッチ)形成における形態学的な異常がないかを調べる。
野生型胚とS1PR多重変異体胚から細胞を調整し細胞特異的な蛍光タンパク質の発現を指標にセルソーターで造血幹細胞などの標的細胞を単離する。次に野生型とS1PR多重変異体胚の間で発現強度が異なる遺伝子群をマイクロアレイ解析あるいはRNAシークエンス解析により探索する。上記の解析で得られた候補遺伝子に対して、CRISPR/Cas9法を用いた効率的な機能欠損ゼブラフィッシュの作成法を用い標的遺伝子を破壊した時の表現型解析からS1Pシグナルとの機能的な関連性を明らかにする。
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