Investigation of molecular mechanism governing open chromatin formation in mouse ES cells

2018 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H03687
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 丹羽 仁史 熊本大学, 発生医学研究所, 教授 (80253730)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: エピジェネティクス / ヒストン / アセチル化

Outline of Annual Research Achievements

Myst複合体は、進化的に保存されたMyst(HAT)-PHF factor-Ing4/5-Meaf6のヘテロ４量体を構成している。その共通因子であるMeaf6の機能を解析するために、誘導型ノックアウトES細胞を作成した。ES細胞でMeaf6の機能を喪失させると、細胞は１継代後に死滅したことから、その機能はES細胞の自己複製維持に必須であることがわかった。次にMeaf6の欠損がMyst複合体の活性に与える影響を検討するために、Meaf6欠損後のヒストンのアセチル化状態をWestern blot法により解析した。Meaf6がMyst複合体の共通因子であることから、その欠損はアセチル化の低下を齎すことが予想されたが、それとは逆に、ヒストンアセチル化の全般的な亢進が観察された。さらに、Meaf6の欠損がMyst複合体の形成に与える影響を検討するために、Meaf6欠損を誘導した細胞でMyst2の免疫沈降を行い、沈降物を質量分析法で解析した。その結果、Meaf6が存在しない状態でも、Myst2はPHF factorであるJade1, Brpf3、そしてIng4/5と結合していた。また、沈降ペプチドの量比から、Meaf6非存在下では、Myst2とPHF factorの結合が亢進している可能性が示唆された。これらの結果は、Meaf6がMyst複合体のヒストンアセチル化能を負に制御する因子であることを示唆している。Meaf6は酵母でも保存されているHAT複合体の構成因子であるにもかかわらず、これまでいかなる種のホモログについても、その機能は報告されていない。本研究成果は、その端緒となる可能性がある。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の目的であるES細胞特異的なヒストンアセチル化の機能ではないものの、これまでに解明されていないMyst複合体の構成因子Meaf6の機能解明に迫りつつあることは、基礎生物学的に重要な成果と考える。

Strategy for Future Research Activity

これまでに作成しているMeaf6誘導型ノックアウトES細胞において、さらにMyst2ないしはMyst4をノックアウトし、これらの基質特異性に従って、Meaf6欠損によるヒストンアセチル化亢進が抑制されるかを検討する。また、Meaf6の有無により、Myst2がそのヒストン認識に必要な複合体コンポーネントであるJade1やBrpf3との相互作用の強度を変えるのかどうかを、免疫沈降法により検討する。さらに、Meaf6誘導型ノックアウトES細胞に、これを均一に分化誘導するためのホルモン誘導型転写因子Gata6GRやCdx2GPRhを導入した細胞株を作成する。そして、これらをDexamethasoneやRU486で分化誘導後に、TamoxifenによるCre活性誘導でMeaf6を欠損させることにより、Meaf6の必要性がES細胞特異的な現象なのかどうかを検討する。