2018 Fiscal Year Annual Research Report
レドックスシグナル伝達において活性カルボニル種はどのように特異的作用をもたらすか
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17H03700
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| Research Institution | Yamaguchi University |
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Principal Investigator |
真野 純一 山口大学, 大学研究推進機構, 教授 (50243100)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
村田 芳行 岡山大学, 環境生命科学研究科, 教授 (70263621)
北島 佐紀人 京都工芸繊維大学, 応用生物学系, 准教授 (70283653)
松井 健二 山口大学, 大学院創成科学研究科, 教授 (90199729)
山内 靖雄 神戸大学, 農学研究科, 助教 (90283978)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 酸化シグナル / 活性酸素 / 過酸化脂質 / 活性カルボニル / 親電子物質 / グルタチオン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物細胞の酸化シグナルメディエーターである活性カルボニル種（RCS）の生成制御機構，および作用メカニズムの解明を目的として，以下の研究を行った。(1) RCS消去活性を持つグルタチオントランスフェラーゼ（GST）アイソザイムの網羅的探索，(2) アブシシン酸（ABA）による気孔閉口シグナルをRCSが促進するメカニズムの解明，(3) オーキシンによる側根形成シグナルをRCSが促進するメカニズムの解明。(4) RCSによるプログラム細胞死（PCD）開始メカニズムの解明。
平成30年度の成果：(1) 大腸菌で発現させ精製したシロイヌナズナの28種のTauアイソザイム（GSTU）のうち，11種がアクロレインを消去し，うち6種は他のRCSも消去することを明らかにした。RCSが植物GSTの生理的基質であること，GSTはRCS消去機構の一つであることが示された。(2) ABAによる気孔閉口シグナル伝達において，過酸化水素の下流で生成するRCSが，孔辺細胞のCaイオン濃度上昇を引き起こすことを見出した。Caイオン依存性キナーゼCPK6の欠損株ではRCSを与えても気孔閉口が起こらないことから，RCSによるCaイオンチャネルの活性化が気孔閉口シグナル伝達経路に必須であることが明らかになった。(3) オーキシンによる側根形成シグナル伝達経路において，RCSがオーキシン刺激によって増大すること，RCSによりAux/IAAタンパク分解が促進され，受容体TIR1を欠損したシロイヌナズナはRCSに応答しないなどの結果から，RCSがオーキシンシグナル伝達をフィードフォワード的に調節することが分かった。これは植物ホルモンシグナルと環境ストレスシグナルのクロストーク機構の生化学的説明となる。(4) タバコBY-2細胞にRCSを加えると，カテプシンBが活性化されることでPCDが開始することを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1) シロイヌナズナのGSTUアイソザイムの網羅的基質特異性解析から，植物でのRCS消去／制御におけるGSTの重要性を始めて明らかにすることができた。当初はアクロレインのみを対象として消去活性を探索していたが，さまざまなRCSに対する基質特異性を調べた結果，生理的に重要なHNEなどを消去するアイソザイムの存在を新たに見いだした。
(2) 孔辺細胞のABAシグナル伝達において，RCSの作用点を絞り込むことができた。今後は研究計画に基づき，RCSが作用するシグナル伝達成分（タンパク質）を特定する。研究期間内に達成可能である。
(3) オーキシンの側根形成作用に対してRCSがフィードフォワード的な関わりをもつことを初めて明らかにした。この結果は学術誌に投稿後，審査では重要性が認められ，現在補足データを加えた改訂稿を再投稿した段階である。研究期間中にインパクトの高い研究成果発表が達成される。
(4) RCSによるプログラム細胞死の際に活性化されるカスパーゼ３活性の本体はカテプシンBであることが阻害剤の結果から明らかになった。2019年度はカテプシンBタンパク質の活性化メカニズムを解明し，成果を発表する予定である。
(5) タバコBY-2細胞に過酸化水素を与えると，HNE消去酵素が敏感に失活することを発見した。現在この酵素の精製，同定を進めている。本酵素の失活メカニズムの解析により，細胞が活性酸素に応答してRCSを増大させる新たなメカニズムが明らかになる。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) RCSを消去するGSTアイソザイムを過剰発現するシロイヌナズナ植物を作成し，ストレス応答やホルモン応答への影響を解析し，RCSの生理学的重要性を解明する。(2) RCSはGSTによってグルタチオン抱合体化されるが，その抱合体の代謝経路は植物では未解明である。アクロレインーグルタチオン抱合体の代謝経路をLCMS解析で解明する。(3) ABAの気孔閉口シグナル伝達経路においてRCSの作用点を明らかにするため，孔辺細胞でABAに応答してRCS修飾を受けるタンパク質を同定する。これによって酸化シグナルとABAシグナルのクロストークポイントが特定でき，2つのシグナルの相互作用メカニズムが明らかになる。(4) オーキシンの側根形成シグナル伝達経路におけるRCSの作用点はTIR1タンパク質であるとの仮説に対し，組換えTIR1タンパク質を精製し，RCS修飾によってAux/IAAタンパク質との結合が強まることを表面プラズモン共鳴などを用いて検証する。これによって酸化シグナルとオーキシンシグナルのクロストークポイントが特定でき，2つのシグナルの相互作用メカニズムが明らかになる。(5) カテプシンBがRCS修飾を受け，そのカスパーゼ３様活性が活性化されることを組み換えタンパク質を用いて検証する。さらに被修飾部位を解明する。これによって，酸化シグナルによるプログラム細胞死開始メカニズムが生化学的に解明される。(6) タバコBY-2細胞から，過酸化水素に感受性を持つHNE消去酵素を単離精製し，タンパク質を同定するとともに，その失活メカニズムを明らかにする。これによって，植物の新たな活性酸素センシング機構を提唱する。
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