2018 Fiscal Year Annual Research Report
Development of novel biological survey method using environmental DNA/RNA: estimating the behavior and states of underwater organisms
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17H03735
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
源 利文 神戸大学, 人間発達環境学研究科, 准教授 (50450656)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山中 裕樹 龍谷大学, 理工学部, 講師 (60455227)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 環境DNA / 環境RNA / オオサンショウウオ / ゼブラフィッシュ / RNA/DND比 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、環境DNA濃度の時間変化、環境RNA、環境DNAのメチル化状態の3つのマーカーを用いて水中生物の行動や状態を知る手法の開発を当初目的とした。このうち、申請時点からチャレンジングであったメチル化状態については昨年度の時点で検討を中止し、環境DNAと環境RNAに注力することとしている。
環境DNA分析では、オオサンショウウオを対象として兵庫県の羽束川および本年度から新たに調査地に加えた広島県の江の川水系の小河川において調査を行った。マーカーとして当初計画のミトコンドリアDNAに加えて核DNAも用いた。その結果、産卵行動に伴って環境DNA量が増加すること、産卵を示す環境DNAの一時的なピークは1日程度で消失すること等を明らかにした。また、小河川規模では環境DNAが反映する範囲は最大200m程度であることも判明した。
環境RNA分析においては、ゼブラフィッシュを対象とした室内実験を実施した。昨年開発したハウスキーピング遺伝子（b2m）以外に、鰓表皮、腸管上皮、体表でそれぞれ多く発現する遺伝子に対して新たなプライマーセットを作成した。水槽水から得た環境RNAサンプルからこれらの遺伝子に由来するmRNAを検出することができ、水生生物が水中に放出している環境DNAおよびRNAが外胚葉由来の組織細胞に由来するものだという傍証を得ることができた。また、給餌ありなしの条件で飼育した魚を用意し、筋組織および飼育水中から得た核酸試料について、チトクロームb遺伝子のDNAとRNAの量を相対比較した。予備解析の結果、絶食条件にあった個体では両試料ともに、RNA/DNAの比率が低い傾向がみられた。RNA/DNA比は、たんぱく質合成活性と関連しており、健康状態の目安として利用されてきた指標である。本結果から、環境水中から回収した核酸に基づいて、対象生物の活性について情報を得られる可能性が示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題では環境DNA濃度の時間変化、環境RNA、環境DNAのメチル化状態の3つをマーカーとして水中生物の行動や状態を知る手法の開発を行うことを計画していたが、予備的検討の結果から環境DNAのメチル化状態は適切なマーカーでない可能性がでてきたため、平成29年度の時点で環境DNA濃度の時間変化と環境RNAに注力することとして研究を進めている。
環境DNAでは、当初計画よりも調査範囲を広げ、人工巣穴のある広島県の河川を調査地に加えた。この結果産卵のタイミングを確認しながら環境DNA濃度の変化を調べることが可能になり当初計画していなかった産卵のタイミングをどれほどの時間精度で測れるかという重要な情報を得ることができた。
環境RNAでは、当初は繁殖に関わるメッセンジャーRNAマーカーを探索する予定であったが、ゼブラフィッシュの飼育条件下での繁殖のコントロールが困難であったこと、また、そもそもの基礎となる環境水中からのRNAの回収・抽出がDNAの場合と比べると安定していないことがあり、より基礎的な実験に集中した。これまでにRNAの回収量や時間的な水中での分解など、環境RNAの水中での動態をより精密に明らかにすることが不可欠と判断して、それを可能とするハウスキーピングの定量系の開発を終えた。引き続き、安定的なRNAの安定的な分析方法を探るべく検討を続ける。また、コイを対象とした繁殖に関わるマーカーの検出系開発を進めており、複数の繁殖期特異的マーカー候補を発見している。
このように当初計画からの変更はあるものの、より基礎の部分を精緻に進めていることや、別のアプローチとしてRNA/DNA比を分析して成果をあげていることなどから、全体としては当初予定と比較して見劣りしない成果が得られていると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度である平成31年度も環境DNAと環境RNAの分析に注力する。
環境DNAでは、これまでのオオサンショウウオに加え、コイ、ブルーギル、オオクチバスの産卵行動の検出を試みる。これは、当初計画にはなかったことであるが、これまでの研究の進展を受けて変更するものである。
環境RNAでは、ひきつづきゼブラフィッシュの水槽実験を行うことに加え、コイの野外水槽実験を行う。コイの野外水槽実験は当初計画にあった野外のフィールド調査に代えて行うものである。これまでのフィールドでの検証結果が安定しないため、よりコントロールのしやすい環境で研究を進めるためである。
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