青枯病菌の病原性細胞集団構造物バイオフィルムの形成に関わるシグナル伝達系の解明

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H03773
• Research Institution: Kochi University
• Principal Investigator: 曵地 康史 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 教授 (70291507)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 甲斐 建次 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 講師 (40508404) ; 大西 浩平 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 教授 (50211800) ; 木場 章範 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 教授 (50343314)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: 青枯病菌 / マッシュルーム型バイオフィルム / ラルフラノン / LecM

Outline of Annual Research Achievements

トマト植物から抽出した細胞間隙液を用いて、走査電子顕微鏡観察にて、青枯病菌によるマッシュルーム型バイオフィルム（mBF）形成能を質量的に解析しうるモデル実験系を構築し、細胞間隙環境における青枯病菌によるmBF形成の時系列的解析を行ったところ、細胞間隙環境で培養12-16時間行うと、マイクロコロニーが形成された。マイクロコロニーのおおよそ1/3が、培養24時間で成熟したmBFに発達することが明らかとなった。そして、培養36時間後にはmBFの崩壊が認められ、浮遊型細菌細胞の放出が行われた。
ラルフラノン化合物産生能喪失株（ΔralA）とラルフラノン化合物を用いたモデル実験系解析から、ラルフラノン化合物、とくに、ラルフラノンJとラルフラノンKがマイクロコロニーからマッシュルーム型バイオフィルムへの発達段階に関与していることが明らかとなった。さらに、lecM遺伝子変異株は、固相面への固着が行えず。マイクロコロニー形成を行うことができず、mBF形成に至らなかった。
3-hydroxymyristate認知により起動するクオラムセンシング（phc QS）のmBF形成への関与について解析を行ったところ、phc QSは、マイクロコロニー形成を抑制していた。一方、ラルフラノン化合物、とくにラルフラノンJとラルフラノンKは、その作用を阻害していることが明らかとなった。
以上の結果から、細胞間隙環境におけるmBF形成は、一般的に、細菌で言われている細菌細胞の凝集によるバイオフィルムとは形態的かつ機能的に異なる青枯病菌の細胞集団構造物であり、その形成には、ラルフラノン化合物とLecM、およびそれらの産生の誘導に関わるphc QSが統合的に関与していると推察された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

平成29年度の研究計画は、
「mBF の形成過程の時系列的解析」と「RS-IIL とラルフラノン化合物のmBF 形成における役割の解析」による「RS-IIL とラルフラノンのmBF 形成における役割の細胞集団構造学的解明」とともに、「RS-IIL を介したmBF 形成に関わるシグナル伝達系の解明」について「RS-IIL により発現が制御されるmBF 形成に関わる転写制御因子遺伝子ライブラリーの構築」、および「ラルフラノン化合物受容を介したmBF 形成に関わるシグナル伝達系の解明」について「ラルフラノン化合物の受容システムの解明」を行うことである。「ラルフラノン化合物の受容システムの解明」については、青枯病菌OE1-1株のゲノム解析からセンサーカイネースをコードしていると推定された44個のセンサーカイネース遺伝子それぞれの欠損株の作製を終了している。そのため、それぞれの項目について、omics解析を行うとともに、生化学解析、さらには、モデル系を用いた走査電子顕微鏡による時系列観察により、青枯病菌細胞の集団構造物mBF形成に関わるシグナル伝達系を解明する糸口をつかんだと言える。

Strategy for Future Research Activity

平成30年度は、「RS-IIL を介したmBF 形成に関わるシグナル伝達系の解明」を目標に、「LecM によるmBF 形成に関わる遺伝子発現制御系の解明」について、RS-mBF 菌株インベントリー各菌株のトランスクリプトーム解析をRNA-seq 法を用いて行い、RS-IIL によるRS ライブラリー各遺伝子の発現制御を解明する。
さらに、「RS-IIL を介して産生が誘導されるメタボロームライブラリーの構築」について、トマト細胞間隙液で培養したOE1-1 株、lecM変異株およびRS-mBF 菌株インベントリーの菌株と、組み換えRS-IIL を加用して培養したlecM 変異株のメタボローム解析を行い、RS-IIL によって産生が制御される二次代謝物質のRS メタボロームライブラリーを構築する。そして、「RS-IIL を介したmBF 形成に関わるシグナル伝達系の構築」を行い、これらの結果を総括した成果を基に、in silico 解析を行い、RS-IIL を介したmBF 形成に関わるシグナル伝達系を構築する。

Research Products

• [Journal Article] Involvement of avirulence genes avrA and popP1 of Japanese Ralstonia solanacearum strains in the pathogenicity to tobacco. (2018)
  • Author(s): Chen, L., Dahal, A., Zhang, Y., Rokunuzzaman, Md., Kiba, A., Hikichi, Y. and Ohnishi, K.
  • Journal Title: Physiological and Molecular Plant Pathology Volume: 102 Pages: 154-162
  • DOI: 10.1016/j.pmpp.2017.12.007.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] The SEC14 phospholipid transfer protein regulates pathogen-associated molecular pattern-triggered immunity in Nicotiana benthamiana. (2018)
  • Author(s): Kiba, A., Nakano, M., Ohnishi, K. and Hikichi, Y.
  • Journal Title: Plant Physiology and Biochemistry Volume: 125 Pages: 212-218
  • DOI: 10.1016/j.plaphy.2018.02.002.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Involvement of ralfuranones in the quorum sensing signaling pathway and virulence of Ralstonia solanacearum strain OE1-1. (2018)
  • Author(s): Mori, M., Ishikawa, S., Ohnishi, H., Shimatani, M., Morikawa, Y., Hayashi, K., Ohnishi, K., Kiba, A., Kai K. and Hikichi, Y.
  • Journal Title: Molecular Plant Pathology Volume: 19 Pages: 454-463
  • DOI: 10.1111/mpp.12537.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ralfuranones contribute to mushroom-type biofilm formation by Ralstonia solanacearum strain OE1-1. (2018)
  • Author(s): Mori, M., Hosoi, Y., Ishikawa, S., Hayashi, K., Ohnishi, H., Asai, Y., Ohnishi, H., Shimatani, M., Inoue, K., Ikeda, K., Nakayashiki, H., Nishimura Y., Ohnishi, K., Kiba, A., Kai K. and Hikichi, Y.
  • Journal Title: Molecular Plant Pathology Volume: 19 Pages: 975-985
  • DOI: 10.1111/mpp.12583.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Phosphoinositide 3-kinase participates in L-methionine sulfoximine-induced cell death via salicylic acid mediated signaling in Nicotiana benthamiana. (2017)
  • Author(s): Sumida, S., Ito, M., Galis, I., Nakatani, H., Shinya, T., Ohnishi, K., Hikichi, Y. and Kiba, A.
  • Journal Title: Journal of Plant Physiology Volume: 218 Pages: 167-170
  • DOI: org/10.1016/j.jplph.2017.07.016.
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Ralstonins A and B, lipopeptides with chlamydospore-inducing and phytotoxic activities from the plant pathogen Ralstonia solanacearum. (2017)
  • Author(s): Murai, Y., Mori, S., Konno, H., Hikichi, Y. and Kai, K.
  • Journal Title: Organic LETTERS Volume: 19 Pages: 4175-4178
  • DOI: 10.1021/acs.orglett.7b01685.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Ferulic acid, but not all hydroxycinnamic acids, is a novel T3SS inducer of Ralstonia solanacearum and promotes its infection process in host plants under hydroponic condition. (2017)
  • Author(s): Zhang, Y., Li, J., Zhang, W., Wang, R., Qiu, Q., Luo, F., Hikichi, Y., Ohnishi, K., and Ding, W.
  • Journal Title: Frontires in Plant Science Volume: 8 Pages: 1595
  • DOI: org/10.3389/fpls.2017.01595.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Regulation involved in colonization of intercellular spaces of host plants in Ralstonia solanacearum. (2017)
  • Author(s): Hikichi, Y., Mori, Y., Ishikawa, S., Hayashi, K., Ohnishi, K., Kiba A. and Kai, K.
  • Journal Title: Frontires in Plant Science Volume: 8 Pages: 967
  • DOI: 10.3389/fpls.2017.00967.
  • Peer Reviewed
• [Presentation] 青枯病菌OE1-1 株の主要な菌体外多糖EPS I は，クオラムセンシングによる制御される遺伝子発現に寄与する (2018)
  • Author(s): 林 一沙・氏田夢斗・大西浩平・木場章範・甲斐建次・曵地康史
  • Organizer: 日本植物病理学会平成30年度大会
• [Presentation] lasI 遺伝子は青枯病菌OE1-1 株のhrpの発現制御に関与する (2018)
  • Author(s): 林 一沙・甲斐建次・木場章範・大西浩平・曵地康史
  • Organizer: 日本植物病理学会平成30年度大会
• [Presentation] Chloroplastic proteins are the targets for the Ralstonia solanacearum type III effectors (2018)
  • Author(s): Dahal, A., Kharel, L., Kiba, A., Hikichi, Y. and Ohnishi, K.
  • Organizer: 日本植物病理学会平成30年度大会
• [Presentation] ラルフラノン化合物は青枯病菌によるマッシュルーム型バイオフィルム形成に関与する (2018)
  • Author(s): 曵地康史・林 一沙・井上加奈子・大西浩平・木場章範・甲斐建次
  • Organizer: 日本細菌学会第91回総会
• [Presentation] 二次代謝物質による青枯病菌のクオラムセンシングのフィードバック制御 (2018)
  • Author(s): 林 一沙・甲斐建次・大西浩平・木場章範・曵地康史
  • Organizer: 日本細菌学会第91回総会
• [Presentation] Chloroplastic proteins are targets of the RipG effectors of Ralstonia solanacearum (2018)
  • Author(s): Amol Dahal，木場章範，曵地康史，大西浩平
  • Organizer: 日本細菌学会第91回総会
• [Presentation] 青枯病菌OE1-1株のクオラムセンシングに関わる新奇センサーカイネース遺伝子の同定 (2017)
  • Author(s): 林一沙・石川詩歩・森友花・木場章範・大西浩平・甲斐建次・曵地康史
  • Organizer: 日本植物病理学会平成29年度大会
• [Presentation] ラルフラノン化合物は、青枯病菌OE1-1株のクオラムセンシングのフィードバック制御に関与する (2017)
  • Author(s): 森友花・石川詩歩・林一沙・木場章範・大西浩平・甲斐建次・曵地康史
  • Organizer: 日本植物病理学会平成29年度大会
• [Presentation] ラルフラノン化合物は、クオラムセンシングにより阻害される青枯病菌OE1-1株のマッシュルーム型バイオフィルム形成を抑制する (2017)
  • Author(s): 森友花・細井勇希・石川詩歩・林一沙・浅井 遊・木場章範・大西浩平・甲斐建次・曵地康史
  • Organizer: 日本植物病理学会平成29年度大会
• [Presentation] 青枯病の化学防除を志向したクオラムクエンチング法の開発 (2017)
  • Author(s): 吉原彩華・嶋谷美香・曵地康史・甲斐建次
  • Organizer: 日本植物病理学会平成29年度大会
• [Presentation] 青枯病菌TonB-dependent receptorの機能解析 (2017)
  • Author(s): 大西浩平・渡邊諒介・木場章範・曵地康史
  • Organizer: 日本植物病理学会平成29年度大会
• [Presentation] Involment of ralfuranones in the quorum sensing signaling pathway and virulence of Ralstonia solanacearum strain OE1-1. (2017)
  • Author(s): 1.Hikichi, Y., Mori, Y., Hayashi, K., Kiba, A., Ohnishi, K. and Kai, K.
  • Organizer: The 7th Congress of European Microbiologists
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Chemical quorum quenching attenuates Ralstonia solanacearum virulence on plants. (2017)
  • Author(s): Kai, K., Yoshihara, A., Shimatani, M. and Hikichi, Y.
  • Organizer: The 7th Congress of European Microbiologists
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 青枯病菌によるマッシュルーム型バイオフィルム形成機構 (2017)
  • Author(s): 曵地康史・林一沙・木場章範・大西浩平・甲斐建次
  • Organizer: 植物微生物研究会第27回研究集会
• [Presentation] methyl 3-hydroxymyristateをクオラムセンシングシグナルとするRalstonia solanacearum OE1-1株のクオラムセンシングにおいてシグナル伝達に関わる新奇センサーカイネース (2017)
  • Author(s): 林一沙・大西浩平・木場章範・甲斐建次・曵地康史
  • Organizer: 植物微生物研究会第27回研究集会
• [Presentation] 青枯病菌株間におけるC14 型とC16 型のQS シグナル分子の作り分けには合成酵素PhcB の基質特異性が重要である (2017)
  • Author(s): 氏田夢斗、島谷美香、曵地康史，甲斐建次
  • Organizer: 日本農芸化学会 関西・中四国・西日本支部 2017年度合同大阪大会
• [Presentation] Ralstonins A and B, unique lipopeptides synthesized by quorum sensing-dependent PKS-NRPS in Ralstonia solanacearum. (2017)
  • Author(s): 1.Yuta Murai, Shoko Mori, Hiroyuki Konno, Yasufumi Hikichi and Kenji Kai
  • Organizer: 第54回ペプチド研究会