2018 Fiscal Year Annual Research Report
ハダニ類の大容量塩基配列解析によって得られた領域に基づいた超高速簡易識別法の確立
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17H03775
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| Research Institution | Ryutsu Keizai University |
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Principal Investigator |
後藤 哲雄 流通経済大学, 経済学部, 教授 (60178449)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
粥川 琢巳 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 主任研究員 (70580463)
坂本 洋典 国立研究開発法人国立環境研究所, 生物・生態系環境研究センター, 研究員 (70573624)
北嶋 康樹 茨城大学, 農学部, 准教授 (00431651)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ダニ・線虫管理 / 系統関係 / ゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ハダニ類4属22種23系統(ナミハダニ属10種11系統、マルハダニ属4種、ツメハダニ属5種、マタハダニ属1種、アケハダニ属2種)について、実験計画の「3. 有効な簡易識別用プライマーの設計およびPCRの高速化」に取り組んだ。平成29年度に実施した解析により、全RNA-Seqデータから網羅的に探索した種特異的プライマー候補配列を1種につき15-3,100本得た。平成30年度は、これらの候補配列から設計したプライマーを用いてPCRを行い、種特異的な増幅が確認できるかどうかを検討した。具体的には、（１）プライマー候補配列が含まれる遺伝子配列をアライメントして、種特異的プライマーと対になるプライマー配列を設計した。次年度以降は、これらのプライマーを用いたマルチプレックスPCRを検討するため、PCR増幅産物の長さが種ごとに異なるプライマーセット設計した。（２）（１）で設計したプライマーセットを用いて、解析対象となるハダニ22種23系統をテンプレートとしたPCRを行った。（３）PCR増幅産物を電気泳動で分析し、増幅されるはずの種のみで、想定される断片長のバンドが得られることを確認した。確認できた場合、PCRに用いたプライマーセットを種特異的プライマーとした。（４）想定される増幅断片長のバンドが得られなかった場合、あるいは、複数の系統でバンドが得られた場合、PCRに用いたプライマーセットは種特異的プライマーとして使用できないものと判定した。種特異的プライマーが得られるまで（１）～（４）を繰り返した。その結果、解析対象とした4属22種23系統すべてについて、種特異的プライマーを得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
RNA-Seqデータから得られた種特異的プライマー候補配列の有効性を、識別対象としているハダニのDNAをテンプレートとしたPCRにより確認できた。次年度は、これらのプライマーを用いたマルチプレックスPCRを検討できるため、当初予定通り順調に進行している。
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| Strategy for Future Research Activity |
第一に、平成30年度に得られた種特異的プライマーセットを用いて、マルチプレックスPCR法を確立する。すなわち、複数のプライマーセットを混合した場合のPCRにおいて、単体のプライマーを用いる場合と同様に種特異的なバンドが得られること、および、非特異的なバンドが得られないことを目標とする。反応時間や温度などの条件を検討する他、マルチプレックスPCR専用の酵素（例えば、TaKaRaのMultiplex PCR Kit）の利用を試みる。マルチプレックスがうまくいかない場合は、プライマーの再設計を行い、新たなプライマーを設計し直す。
第二に、ここまでに解析対象としていた22種23系統に加え、新たに13種14系統について、プライマー設計を行う。新たに加える種のうち4種は、RNA-Seqのデータがないため、個体群の採集とRNA-Seqを行う。種特異的プライマー候補の選定は、RNA-Seqデータの網羅的解析により実施するが、これまでにプライマーを設計し終えた種とともに解析し、他種のデータに相同性の高い配列がないことを確認しながら進める。プライマー設計、およびPCRによる増幅確認についても、これまでに解析対象としていた系統を加えた合計35種37系統を用いて実施する。
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