2019 Fiscal Year Annual Research Report
ハダニ類の大容量塩基配列解析によって得られた領域に基づいた超高速簡易識別法の確立
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17H03775
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| Research Institution | Ryutsu Keizai University |
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Principal Investigator |
後藤 哲雄 流通経済大学, 経済学部, 教授 (60178449)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北嶋 康樹 茨城大学, 農学部, 准教授 (00431651)
坂本 洋典 国立研究開発法人国立環境研究所, 生物・生態系環境研究センター, 研究員 (70573624)
粥川 琢巳 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 生物機能利用研究部門, 主任研究員 (70580463)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | ダニ・線虫管理 / 系統関係 / ゲノム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ハダニ類7属34種35系統(ナミハダニ属13種14系統、マルハダニ属4種、ツメハダニ属7種、マタハダニ属2種、アケハダニ属5種、クダハダニ属2種、ヒラタハダニ属1種)について、実験計画の「3. 有効な簡易識別用プライマーの設計およびPCRの高速化」に取り組んだ。令和元年度は、平成30年度にプライマー候補配列の抽出を終えた23系統に加えて、12系統のRNA-Seqおよびプライマー候補配列の抽出を行った。その結果、1系統につき10-6,226本の種特異的プライマー候補配列が得られた。なお、35系統中23系統については、すでに種特異的プライマーと対になるプライマー配列を設計しており、解析対象となるハダニ22種23系統をテンプレートとしたPCRで想定される断片長のバンドが得られることを確認している。また、設計したプライマーを用いて、マルチプレックスPCR法の最適化を行い、最大7種のマルチプレックスが可能であることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和元年度は、これまでに解析対象としていた23系統に加えて、新たに12系統のRNA-Seqおよびプライマー候補配列の抽出を行った。また、マルチプレックスPCR法の最適化により、複数のプライマーセットを１本のチューブで反応させることに成功している。したがって、当初の予定通り順調に進行していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
第一に、マルチプレックスPCR法の確立と最適化を引き続き進める。昨年度の解析では、これまでに解析済の22種に加えて、新たに13種のプライマー設計が完了した。そこで本年度は、マルチプレックスPCR法によるハダニ35種の識別法の確立を最優先で進める。単体のプライマーを用いる場合と同様に、種特異的なバンドが得られること、および非特異的なバンドが得られないようにするために、反応時間や温度などの条件を検討する他、マルチプレックスPCR専用の酵素（例えば、TakaraのMultiplex PCR Kit）の利用を試みる。万が一、マルチプレックスがうまくいかない場合に備え、できるだけ多くのプライマーの設計を同時進行で実施する。
第二に、地域系統差を考慮したプライマーの調整を行う。同種において地域系統が異なる場合でも、有効に識別できるプライマーを調整するために、プライマーとして利用する塩基配列の地域系統間での変異を確認する必要がある。具体的には、プライマー候補配列の外側にプライマーを設計し、各地域系統におけるプライマー候補配列を解読し、地域系統間に変異があるかどうかを確認する。変異が存在し、最初に設計したプライマーによるPCRでは増幅できない地域系統が存在した場合には、変異する塩基を縮重させたプライマーを設計することで、地域系統間の変異に対応する。
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