2017 Fiscal Year Annual Research Report
汚染土壌由来の有害化合物分解コンソーシアム：分解菌に対する共存非分解菌の役割
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17H03781
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
津田 雅孝 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (90172022)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
永田 裕二 東北大学, 生命科学研究科, 教授 (30237531)
大坪 嘉行 東北大学, 生命科学研究科, 准教授 (40342761)
加藤 広海 東北大学, 生命科学研究科, 助教 (90727265)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 土壌汚染防止・浄化 / 有害化学物質 / 細菌 / 遺伝子 / 微生物相互作用 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
有害化合物分解細菌による効率的分解に共存非分解異種細菌が果たす役割とその機構の解明をめざしている。汚染土壌由来のフェナントレン(Phn)分解コンソーシア由来のPhn完全分解Mycobacterium株と非分解Burkholderia株の組み合わせを中心にして、(1) 前者株のPhnによる生育阻害現象を規定する遺伝子、そして、(2)後者株がPhnによる前者株の生育阻害を緩和する現象とPhn分解能を増強する現象に各々関わる遺伝子の同定・機能解析を行っている。
1. Mycobacterium株からPhn耐性能上昇でPhnによる生育阻害の大幅緩和変異体を1株単離した。本変異株ではPhn分解能上昇とともに、野生型株が炭素源にできるが生育阻害をうけるビフェニル(Bph)とナフタレン(Nah)への耐性能上昇も示した。本変異は未知機構での細胞表層構築への寄与が示唆される遺伝子に存在していた。
2. Mycobacterium株はPhn添加で細胞表層構造に支障をきたした。また、液体培地を用いた本株トランスクリプトーム解析で、Phn存在下で当該化合物の推定分解酵素群遺伝子の大幅転写上昇に加え、鉄獲得・代謝系などを支配する遺伝子群の転写上昇や好気呼吸に関わる特定酵素の遺伝子群の転写減少が認められ、Phn添加による多面的転写変動を提示した。
3. Mycobacterium株の対立遺伝子置換系とベクター系を確立し、両系を用いて推定Phn分解経路中間産物の分解への関与想定遺伝子を解析し、想定機能の妥当性を示した。
4. 最小寒天培地でのMycobacterium株のPhnによる生育阻害現象はBurkholderia株の共存で大幅緩和されるが、後者株の5種栄養要求性変異体は緩和効果を消失したため、Burkholderia株の寒天培地での生育が緩和効果発揮に重要と示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Mycobacterium株のPhn存在下での生育阻害の共存非分解異種細菌株による緩和効果の包括的解析には、前者株のPhnによる生育阻害機構の解明が必要なことを踏まえ、今年度においては、当該生育阻害現象の解析に力点をおいた。
Phnによる生育阻害が大幅に緩和したMycobacterium由来変異体を1株取得・解析したが、本現象のさらなる包括的解明のために、本年度構築の効率的トランスポゾン挿入突然変異誘発系を用いて、更に生育阻害現象が緩和した多数の変異体の取得を実施している。Mycobacterium株での上記2種の遺伝学的解析系の確立とPhn分解経路とその酵素遺伝子群の確定を踏まえ、Mycobacterium株とその分解酵素遺伝子変異株に関して、Phn分解の複数中間代謝産物による生育阻害を検討している。一方、野生型のBphとNahの各々による生育阻害に関しても、その分解経路の検討と推定中間産物による生育阻害を検討している。
Mycobacterium株のPhnによる生育阻害現象に対するBurkholderia株の緩和現象の検討のために、最小寒天検定培地とこれにPhnを添加した培地で、各株単独と両株混合の各条件で培養した計6種の細胞集団から調製したmRNAを用いたトランスクリプトーム解析を実施し、Phnと両株が存在する条件で特異的に転写が上昇と減少する各株の遺伝子リストの予備的作成をおこなった。更なる詳細なデータ解析を現在実施している。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究方策の第1として、Mycobacterium株のPhnによる生育阻害現象を司る機構の詳細な分子遺伝学的解析に取り組む。このために、本株のPhnよる生育阻害が大幅に緩和された多数の変異株取得・解析という「ボトムアップ」的手法とトランスクリプトーム解析によりPhn存在下で転写変動が顕著だった遺伝子の破壊株や大量発現株を用いた解析という「トップダウン」的手法を併用する。他の多環芳香族化合物分解細菌株では分解基質による生育阻害が分解に伴い細胞内で上昇した活性酸素(ROS)に起因するという報告例があるが、本研究でのPhnによる生育阻害にはROSが関与しないことを示唆する成果を得ている。従って、ゲノムレベルの遺伝子転写変動の観点からも生育阻害現象を検討するという世界に先駆けた手法を含む本研究で、生育阻害現象を司る新規性の高い分子機構の提示が期待できる。第2として、当該生育阻害の緩和能を示す共存非分解細菌に関しては、遺伝学的解析系が確立している大腸菌株やB. multivorans株が緩和能を備えることを見出していることから、両株のゲノム網羅的突然変異体ライブラリーを用いて、緩和能発揮に関与する遺伝子の同定とその機能提示を行う。第3に、Phnによる生育阻害が消失したMycobacterium変異株を用いて、Burkholderia株共存時におけるPhn分解能増強機構を解明する。第4に、Mycobacterium株とBurkholderia株の組み合わせで、Phn存在下で認められた3現象がBphやNahの存在下でも認められることから、各化合物存在時での現象を司る機構の同一性/多様性の有無を検討する。
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