2017 Fiscal Year Annual Research Report
外膜を有するグラム陽性偏性嫌気性細菌の細胞表層構造と生理に関わる遺伝子群の解析
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17H03786
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
金子 淳 東北大学, 農学研究科, 准教授 (30221188)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Selenomonas ruminantium / plasmalogen / polyamine / transformation |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Selenomonas ruminaitiumは外膜を持つグラム陽性菌である。プラズマローゲンに富んだ内膜とポリアミンが共有結合したペプチドグリカンからなる特異な細胞表層を有し、嫌気条件で唯一の炭素源として乳酸を資化する。本研究では我々が解読した全ゲノム情報を基礎として本菌の特異な性質に関わる遺伝子群を解析する。
【1. プラズマローゲンの生合成機構の解析】PlsX、PlsYにおけるビニルエーテル結合形成に関わる残基の特定：大腸菌におけるPlsX-Yの再構成評価系の安定化を検討し、PlsXの二カ所のシステインをアラニン及びセリンに置換した変異体でPls生産の減少を確認した。同様の結果を枯草菌におけるPlsX-Yの再構成評価系でも確認した。現在、投稿論文を作成中である。PlsX、PlsYの立体構造解析：PlsXの発現生産株の構築に成功した。
【2. 新規外膜保持機構に関わる遺伝子群の解析】 ポリアミン転移酵素および関連タンパク質の同定：大腸菌BL21(DE3)に候補遺伝子(orf2750)とその前後の2751、2749各遺伝子をオペロンとして組み込んで発現系を構築し、酵素活性を解析した。しかし膜画分及びORF2750を追加しても、優位な活性上昇は見られなかった。
【3. 遺伝子の網羅的解析の基盤の確立による嫌気条件化での生理の解析】
シャトルプラスミドベクターの開発と遺伝子破壊ライブラリの構築：推定rep型oriを持つS. ruminantiumの小型のプラスミドpSRC9とクロラムフェニコール耐性遺伝子を大腸菌のクローニングベクターに組み込んだプラスミドが枯草菌で維持されることを確認した。一方、S. ruminantiumのコンピテントセルからシングルコロニーを形成する実験条件を整えた。現在、S. ruminantiumへのエレクトロポレーションによるプラスミド導入を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
【1. プラズマローゲン(Pls)の生合成機構の解析】Pls生合成の再構成解析系では、大腸菌、枯草菌の両システムとも、安定性と生産量の向上に関して改良の余地がある。また、現在TLCを用いている活性測定法を改良し、検出感度を上げることが必要である。PlsXの発現系の構築と条件検討に時間がかかっているため、タンパク質結晶構造解析関連の実験が遅れている。特にHis-tagはN-末端に挿入しても、C-末端に挿入しても機能しないため、精製方法を検討する必要がある。一方、膜酵素であるPlsYは、発現系の構築に難航している。
【2. 新規外膜保持機構に関わる遺伝子群の解析】大腸菌BL21(DE3)候補遺伝子orf2750を単独で発現させた場合、ポリアミン転移活性が微弱であり、オペロンを組む2751、2749各遺伝子の発現産物を添加しても、さらにオペロンごと発現系させても優位な活性上昇は見られなかった。この過程で活性測定の基質の検討、及びそれぞれのタンパク質の発現を確認する必要があることが判明した。
【3. 遺伝子の網羅的解析の基盤の確立による嫌気条件化での生理の解析】大腸菌とS. ruminantiumで機能しうるプラスミドの構築には成功したが、S. ruminantiumへのエレクトロポレーションが難航している。本菌の持つI型制限系の回避の手法を検討する必要が有る。また、汎用の大腸菌-グラム陽性菌のシャトルベクターも合わせて検討する。
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| Strategy for Future Research Activity |
【1. プラズマローゲンの生合成機構の解析】PlsX、PlsYにおけるビニルエーテル結合形成に関わる残基の評価に際し、Pls合成量の定量化を構築する。比較的安定している枯草菌におけるPlsX-Yの再構成評価系を用い、枯草菌本来のplsXをコンディショナルに発現調節可能なホストを構築する。これに平成29年度の成果を応用して枯草菌のPlsXをSelenomonas型に変換した発現プラスミドを導入し、プラズマローゲン生合成能を付与できるか、検討する。さらに影響が強い残基の多重変異体を構築し、PlsXのPls生合成への関与する残基を特定する。並行して大腸菌の系を用いてPlsYについても同様に候補残基を絞り込むとともに、各酵素のin vitro活性評価系の構築を試みる。一方、組換えPlsXをの精製系を確立し、結晶化に必要なタンパク質を得る。膜酵素であるPlsYは発現の改良を試み、推定膜外領域のペプチド抗体を活用して、トポロジー解析を進める。
【2. 新規外膜保持機構に関わる遺伝子群の解析】ポリアミン転移酵素および関連タンパク質の同定でははそれぞれの抗血清を調製し、S. ruminantiumおよび大腸菌発現株で、細胞におけるそれぞれのタンパク質の発現と局在を解析する。一方、ゲノム情報から外膜Mep45ホモログの大腸菌発現系を構築する。また、種々の炭素源で培養した菌体から外膜画分を調製し、二次元電気泳動によりMep45ホモログの発現を解析する。
【3. 遺伝子の網羅的解析の基盤の確立による嫌気条件化での生理の解析】制限系を回避するため、様々なメチラーゼ＋の大腸菌株や、本菌の持つI型制限修飾系の修飾(M)と基質認識(S)成分の遺伝子クラスターを発現する大腸菌株を宿主とし、それを経由したプラスミドをS. ruminantium にエレクトロポレーションで導入して形質転換系を確立する。
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