2018 Fiscal Year Annual Research Report
糸状菌の界面での生物機能を支える界面活性タンパク質の分子機構の解明
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17H03787
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
阿部 敬悦 東北大学, 農学研究科, 教授 (50312624)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
藪 浩 東北大学, 材料科学高等研究所, 准教授 (40396255)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 界面活性タンパク質 / 自己組織化 / 糸状菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
動植物感染を含め、糸状菌は固体高分子を分解して地球規模の物質循環に寄与する。固体に生育する糸状菌は、界面活性タンパク質Hydrophobin（HP）を分泌する。HPは細胞壁多糖に結合・自己組織化して細胞表層を被覆し、糸状菌と固体又は空気界面を形成して標的接着に機能する。HP-多糖複合体は感染宿主からの認識回避で感染成立にも機能する。またHPは固体表面に結合した後に分解酵素をリクルートして固体分解を促進する。HPは固体表面に結合して界面で生物機能を示すが、HPの固体表面への結合・自己組織化過程は不明である。本研究では生化学と界面化学の手法を融合させ、様々な化学構造の固体表面を作製して、表面へのHPの結合・自己組織化過程、自己組織化HPと酵素の相互作用過程を可視化・定量化して、その分子機構モデルを構築する。
本年度は、前年度に引き続き、分子間相互作用解析装置である水晶発振子マイクロバランス(QCM)装置を用いて、疎水性・親水性(アミノ基、カルボキシ基)官能基を末端に有する自己組織化単分子膜(Self Assembled Monolayer: SAM)形成試薬で表面修飾したQCM電極に麹菌由来の精製HPであるRolAを吸着させて、吸着過程をpH4, 7, 10で解析した。その結果、RolAの等電点に近いpH4ではどの表面でも吸着量が多く、吸着量はpH4>pH7>pH10であった。AFMで吸着構造を観察すると、疎水面のpH4、pH7で棒状構造が多く観察された。前年度の結果が再現されQCM電極での解析を完了した。
本年度は新たに、より精密なRolA自己組織化構造解析を目的に、より高平滑な親水性シリコン基板を均一疎水化加工し、親水シリコン基板と疎水化シリコン基板を用いて、気液界面上に展開したRolA分子を水平圧縮して両基板に転写し、RolA自己組織化構造のAFM観察に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
【課題１】化学構造の異なる表面へのHPの吸着・自己組織化の生化学的解明
前年度に引き続いてQCMを用いて、親水性(エステル基、OH基)のSAM表面への、RolAの吸着を定量的に解析した。pH4,7,10においてKd値を決定し、論文投稿に必要なデータを取得できた。結論として、RolA の固体表面への親和性は、固体表面の性質に依らず、溶液の pH, つまり溶液中の RolA の状態に依存し、RolA の等電点(pI = 4.8)に近いほど、親和性が増加した。各表面に対して、疎水的相互作用と親水的相互作用両方で吸着することが予想された。pH10ではRolAのゼータ電位が負であることから、RolAが表面に吸着しても静電反発を引き起こし、RolA吸着が極めて少ないことが明らかとなった。
【課題２】HPが各種表面で形成する自己組織化構造の表面化学的解明
①SAM化表面でのRolAの吸着・自己組織化の可視化～課題１のQCM電極に吸着したRolAをAFMで観察した。疎水面のpH4、pH7で棒状構造が多く観察され、吸着量に応じて球状構造から棒状構造に自己組織化構造が成長した。前年度の結果が再現されQCM電極での解析を完了した。
②RolA単分子膜（Langmuir膜：L膜）の作製とその自己組織化構造の解析～気液界面に配向したRolA分子を水平方向に圧縮して緻密な凝固単分子膜(L膜)が形成されたところで固体基板に写し取り、基板表面をAFMで観察した。平滑面としてシリコンを選択した。親水性シリコン膜を均一に疎水化加工する条件検討に手間取り実験に遅れを生じたが、基板Si-OHとのSAM化試薬官能基の選択で解決した。基板上に緻密な自己組織化構造持つRolA-L膜の作製に成功し、自己組織化条件の解析を開始した。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年11月から親水性シリコン基板の疎水SAM化加工を試みていたが、均一加工の条件探索が困難で予定より６か月の遅延が生じたが、SAM化試薬の反応官能基の種類の検討の結果、均一加工に成功し、AFM観察が開始できた。その結果、平成31年7月までに平成30年度の計画を実施できた。SAM化QCM電極を用いたRolA吸着過程の動力学的解析および吸着により形成されるRolAの自己組織化データがまとまったので、現在論文作成の最終段階にある。一方で、気液界面に配向したRolA分子を水平方向に圧縮して緻密な凝固単分子膜(Langmuir膜；L膜) AFM観察に成功したので、平成31年4月以降は親水性シリコン基板と疎水化シリコン基板を用いて、L膜のAFM観察を継続し、論文投稿用データを取得する予定である。
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