2018 Fiscal Year Annual Research Report
ペプチダーゼ最大ClanPA唯一のエキソペプチダーゼファミリーの構造機能相関解明
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17H03790
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| Research Institution | Nagaoka University of Technology |
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Principal Investigator |
小笠原 渉 長岡技術科学大学, 工学研究科, 教授 (40292172)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | S46ペプチダーゼ / 基質認識機構認識機構 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、申請者が先導研究してきた非病原菌Pseudoxanthomonas mexicana WO24由来S46ペプチダーゼをモデル酵素とし、病原菌由来S46ペプチダーゼの網羅的な基質特異性解析およびサブサイトとα-ヘリカルドメインを中心とした構造機能相関の解明を行う。最終的には、Family S46構造機能相関の完全解明を目的としている。さらに、本研究は、ヒトが有しないS46ペプチダーゼをターゲットとした、歯周病原因菌、多剤耐性日和見感染菌を抑制可能な創薬開発への基礎研究となる本年度は以下の「課題（１）S46群の構造解明」、「課題（２）S46群の網羅的基質特異性の解明」、「課題（３）S46 基質認識機構の解明」を行った。
課題（１）S46群の構造解明 多剤耐性日和見感染由来SmDPP7とジペプチドとの共結晶構造解析に成功した。また、歯周病原因菌由来PgDPP11の高分解能な構造解析に成功し、ドッキングシミュレーションからPgDPP11に特異的な阻害化合物を発見した。今後は、結晶化に成功していない標的タンパク質の純度向上を目指す。
課題（２）S46群の網羅的基質特異性の解明 ジペプチドライブラリーを用いた競合阻害試験により、S46群の基質P2特異性を明らかにした。これにより、病原菌由来S46ペプチダーゼ群の共通した基質P2特異性を示すことに成功した。
課題（３）S46 基質認識機構の解明 SmDPP7をモデル酵素とした変異解析によって基質P2認識に重要とされる残基の同定に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
課題（１）S46群の構造解明 院内感染の起因菌で肺炎や菌血症での死亡率が5～7割に達する多剤耐性日和見感染菌Stenotrophomonas maltophilia に由来するSmDPP7についてジペプチジドとの共結晶構造解析に成功した。さらに、日本成人の7割が有病している歯周病の主な原因菌であるPorphyromonas gingivalisに由来するPgDPP11に高分解能な結晶構造解析に成功し、ドッキングシミュレーションを経て、S46群に特異的な阻害剤の発見に至った。
課題（２）S46群の網羅的基質特異性の解明 標的S46群の基質P2特異性をジペプチドライブラリーを用いた競合阻害試験により決定した。これにより、病原菌由来S46ペプチダーゼ群の共通した基質P2の嗜好性を明らかにした。さらに、オリゴペプチドを用いてP2・P1特異性の解析に必要なHPLCを用いたジペプチドの検出基盤構築を試みたが、既存の検出方法ではジペプチドの検出が困難な場合があることが明らかになった。そのため、今後はLC/MSなど他のジペプチド検出手法を検討していく。
課題（３）S46 群の基質認識機構の解明 SmDPP7のジペプチドとの共結晶構造解析と部位特異的変異解析からS2サブサイトにおける認識に重要な残基の同定に至った。さらに、S2サブサイトへの基質の収容にはサブサイト下部における水素結合ネットワークが寄与していることが見出された。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）S46群の構造解明 結晶化に成功していないS46群、PgDPP7、SpDPP11、PeDPP7、PeDPP11、SmDPP11の精製純度の向上および結晶構造の取得を目指し、S46群の構造解析を行う。特にSubfamily S46Sに属するSpDPP11およびSmDPP11の構造解析に成功していないため、優先して結晶構造の取得を目指す。
（２）・（４）S46群の網羅的基質特異性およびイミド結合切断能の解明 羅的基質特異性およびイミド結合切断能の解明のため、本研究では、長鎖ホルモンを含む様々なオリゴペプチドを基質とした解析を実施予定である。次年度はジペプチド検出基盤の構築を目指す。
（３）S46基質認識機構の解明 基質認識残基の基質特異性への寄与を解析するため、DAP BIIをモデル酵素とした変異解析によって基質認識に関与している残基の同定を目指す。また、精製に成功している他のS46群についても同様に変異解析を行い、S46群の基質認識機構の解明を試みる。また、網羅的に基質認識残基を解析することで、基質認識構成残基と基質特異性の相関関係を明らかにする。また。本年度に見出されたS2サブサイトにおける水素結合ネットワークに寄与をITCを用いて検証していく。
（５）S46α-ヘリカルドメインの機能解明 S46α-ヘリカルドメインの機能解明のため、基質の選択性とその相関性を明らかにするための活性測定と共結晶構造解析を試みる。また、S46α-ヘリカルドメインを置換や欠損させた、キメラタンパク質を発現・精製し、基質長・構造特異性の変化を観察する。さらに、豊富にあるアミノ酸配列等の情報を用いたドライ解析からも、S46α-ヘリカルドメインの機能解明に迫る。
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[Journal Article] 微生物由来エキソ型ペプチド分解酵素の構造から創薬へ2019
Author(s)
阪本 泰光, 六本木 沙織, 鈴木 義之, 石原 司, 日高 興士, 中村 彰宏, 本間 宣行, 小笠原 渉, 田中 信忠
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Journal Title
Int. J. Microgravity Sci. Appl.
Volume: 36
Pages: 306106
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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[Presentation] Structure comparisons of dipeptidyl aminopeptidase IV family2019
Author(s)
六本木沙織, 鈴木義之, 館岡千佳, 藤本真友, 森澤さおり, 飯塚一平, 中村彰宏, 本間宣行, 伊藤康広, 志田洋介, 小笠原渉, 田中信忠, 阪本泰光, 野中孝昌
Organizer
2018年度量子ビームサイエンスフェスタ
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[Presentation] Elucidation of Substrate Recognition Mechanism of Dipeptidyl Aminopeptidase IV from Gram-negative Bacteria Pseudoxanthomonas mexicana WO242018
Author(s)
Akihiro Nakamura, Nobuyuki Honma, Saori Roppongi, Yoshiyuki Suzuki, Yosuke Shida, Yasumitsu Sakamoto, Koji Inaka, Hiroaki Tanaka, Kiyoito Kihira, Mitsugu Yamada, Izumi Yoshioka, Hiroaki Gouda, Takamasa Nonaka, Nobutada Tanaka, and Wataru Ogasawara
Organizer
The 7th International GIGAKU Conference
Int'l Joint Research
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