2018 Fiscal Year Annual Research Report
Studies on formation mechanism of nano-organelle in growing cells by live-cell time-lapse fluorescence imaging analyses.
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17H03791
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
福森 義宏 金沢大学, その他部局等, その他 (60135655)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | イメージング / 磁性細菌 / 原核細胞 / オルガネラ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、細菌に磁気感知という特性をもたらしているナノサイズの原核細胞オルガネラ「マグネトソーム」を生細胞内で可視化することにより、その形成過程の解明に取り組む。これまでマグネトソームの形成過程は、マグネトソーム局在蛋白質の個々の遺伝子欠損株を用いた電子顕微鏡観察結果の静止画的情報をもとに議論されてきた。本研究では、全反射蛍光顕微鏡などを用いて、生細胞内でのマグネトソーム形成機構を時空間的に解析する。本年度の研究実績は以下の通りである。
1.マグネトソームアイランドにコードされる遺伝子のうち、mamB, E, I, L, Qの５つの遺伝子は、マグネトソーム小胞形成に必須の遺伝子であり、それぞれ膜蛋白質（マグネトソーム小胞形成蛋白質）をコードしている。このうちMamB, E, I, Qの４つの膜蛋白質の大腸菌での発現系構築に成功した。現在、これらの蛋白質のポリクローナル抗体を作製中である。
2.マグネトソーム形成過程の生細胞蛍光イメージングを行うため、マグネトソーム小胞形成蛋白質とGFPとの融合蛋白質（MamB-GFP, MamE-GFP, MamI-GFPおよび MamL-GFP）を発現する磁性細菌Magnetospirillum magneticum AMB-1株をそれぞれ作製し、小胞形成過程の生細胞蛍光イメージングに必要な実験基盤を構築した。また、これらの蛋白質の細胞内局在を明らかにした。
3.Halotagは多色蛍光による生細胞内イメージングや、細胞内での蛋白質相互作用解析に利用できる多機能性のタグ蛋白質であり、マグネトソーム形成機構の解析に有効である。これまでAMB-1細胞内でのHalotag発現は達成されていなかったが、本研究でhalotag遺伝子のコドンとプロモーターの最適化を行うことでAMB-1でのHalotag発現に初めて成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
mamB, E, I, L, Qはすべての磁性細菌に保存される遺伝子であり、遺伝子欠損株の観察結果からマグネトソーム形成に必須とされているが、これらの遺伝子にコードされる蛋白質の細胞内局在や機能は不明である。今年度の研究成果により、M. magnetotacticum AMB-1におけるMamB, MamE, MamI, MamL, および MamQ蛋白質の細胞内局在を観察した。また、これらのマグネトソーム小胞形成に関わる蛋白質の生細胞蛍光イメージングの実験系の構築に成功した。さらに、これらの蛋白質の大腸菌での発現、精製を行い蛋白質レベルで、マグネトソーム小胞形成機構を調べるための実験基盤を構築した。さらに、Halotag蛋白質のM. magnetotacticum AMB-1における発現に成功した。今後、Halotagを用いた多重蛍光生細胞イメージングや蛋白質相互作用解析による研究進展が期待される。以上のように、研究計画に従い順調に進展しており（２）を選択した。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに作製したマグネトソーム小胞形成蛋白質MamB, E, I, LおよびQとGFPとの融合蛋白質の発現系と、マグネトソームの形成を分子生物学的に制御できる磁性細菌株(QInd株)を用いて、マグネトソーム小胞の形成過程を生細胞蛍光イメージング法で観察する。QInd 株では、マグネトソーム小胞形成に必須のmamQ 遺伝子が欠失しており、プラスミド上からIPTG 依存的にMamQ蛋白質を発現させることで、マグネトソームの形成を任意のタイミングで起こすことができる。得られた株において、マグネトソーム形成に重要な機能を持つ蛋白質のマグネトソーム小胞形成時の細胞内動態を、生細胞蛍光イメージングにより観察することで、これらの蛋白質がどのようにマグネトソーム小胞形成に関わり、形成されたマグネトソームをどのように細胞内配置するかを解析する。観察に高度な空間解像能が必要な場合は、超解像レーザー顕微鏡（TCS-STED）を用いて、詳細な局在を調べる。さらに、Halotagを用いた細胞内蛋白質相互作用の解析技術を用いて、マグネトソーム小胞形成蛋白質MamB, E, I, Q, L間の蛋白質相互作用を調べ、マグネトソーム小胞形成の分子基盤を検証する。
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