2019 Fiscal Year Annual Research Report
Molecular Mechanism and Applications of Rare Earth Elements-Dependent Stimulation in Microbial Production of Stereo-Regular (Homochiral) Poly-gamma-Glutamate as Novel Extremolyte-Like Materials
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17H03796
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
芦内 誠 高知大学, 教育研究部総合科学系生命環境医学部門, 教授 (20271091)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 超広域環境微生物 / 環境適応因子 / ポリγグルタミン酸 / レアメタル（レアアース）バイオロジー / バイオツール化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
堆肥から深海底までの地球環境に高度の適応した土壌細菌“巨大菌”にレアアース（特にジスプロシウム）を与えつつ培養すると、優位に増殖速度が増加することに加え、ポリγグルタミン酸（ＰＧＡ）と呼ばれる有用バイオポリマーの生細胞当たりの生産能まで増大するという画期的な応答現象を発見した。レアメタル（レアアース）は、いわゆる重金属であることから、生物応答に関しては毒性や代謝抑制ありきの解析に焦点が絞られる中、本件は生物と重金属の新たな接点に焦点を当てる千載一遇の機会と判断した。技術的な部分ではその分子レベルでのエビデンスを得るための方法論確立を急ぐ必要があった。まずＰＧＡ増産現象に着目し、巨大菌と（レアアース応答性に乏しい）納豆菌のＰＧＡ合成遺伝子オペロン、特に発現制御を担う非翻訳領域を計算化学分析（二次構造形成による自由エネルギー変動など）に供した。今回、ＧＣ含量や構造遺伝子群の配置構成など、一般的な比較遺伝生化学上の類似性を示すが故に見落とされてきた実像が浮き彫りになった。具体的には、巨大菌においてのみ、バシラス属細菌の（多様な外因性ストレスや環境因子への応答を指揮する）グローバルレギュレータの中でも最上位に位置するＤｅｇＵ認識部位が複数個所見つかった。詳細分析を続けた。結果、推定転写開始点の約２００塩基対上流には金属応答性リボスイッチ様の特殊塩基配列が見つかった。興味深いことに、ここにはＤｅｇＵ認識部位と重複する領域も存在した。ＰＧＡ合成の環境因子制御に迫る”ホットスポット”の同定等、画期的な発見に繋がる。事実、巨大菌は高C/N比の富栄養下で炭素ベースのバイオプラスチックポリマーを蓄積するが、低C/N比かつ高塩条件に曝すと、一転してＰＧＡを作りはじめる。外部刺激に応じて環境適応因子の代謝経路を転換する等、超広域環境微生物が備えるべき高度な適応戦略に、初めて分子解析のメスが入った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ＰＧＡ生産菌として最も有名な“納豆菌”にレアアース応答性が見つからないことが、当該研究の特殊性をさらに高めている。すなわち、もはや飼い慣らされた食品発酵微生物にとって環境の変化に対する鋭敏応答はそれほど必要ではないのであろう（育種という人為操作の中で脱落したと考えてもよい）。実際、納豆菌におけるＰＧＡの生理学的意義は全く分かっていない（納豆ＰＧＡの場合、菌の生存戦略ではなく食品嗜好の観点から残されただけの存在）。このような状況はＰＧＡを環境適応因子として捉えることを難しくしてきた。今回、超広域環境微生物“巨大菌”に焦点を当てたことがブレークスルーとなり、さらに分子レベルでのエビデンスの発見にも繋がった。実際、高次機能領域（推定レアアース結合ループやＤｅｇＵ認識配列等）を含む当該調節遺伝子部位（Ｃａｐ_5’-ＵＴＲ）とＤｅｇＵの相互作用において、ＤｅｇＵだけでは不十分であることが課題になっていたところ、新たに計画した本年度の調査（ゲルシフトアッセイを含む）において、ＤｅｇＵ～Ｐとジスプロシウム（Ｄｙ）の共存が必須であることが判明したのは画期的であった。しかもその効果はＤｙ濃度依存的に発揮されることまで分かってきた。知る限りにおいて、前例のない生命現象の分子機構であったことから、学術的なインパクトの高い科学誌への投稿と産業利用を視野に入れた特許出願を計画している。情報公開までのタイムラグの時期にある一方、その微生物学に与える波及的効果や発展性は相当以上と見込まれることを鑑み、当該年度に関しては「おおむね順調に進展している」との評価に値する成果を得ることができたとの結論としたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
三年次の成果は“起承転結”でいうところの「転」にあたる。地球土壌環境中にごく微量ながら広く存在しているとされる希土類（レアアース）のメタル（レアアース）バイオロジーの発展と充実に繋がる極めて重要な発見に至り、ブレークスルーに足る局面にあるとの認識を得ている。本件のひとつの「結」と考える「産業応用を意識した新境界研究“レアアースバイオエンジニアリング”」の幕開けを意識した最終年度としたい。以下、推進する二つの中課題についての方針を示す。
①ＤｅｇＵ～Ｐ安定化因子の同定と機能分析：当該状態の安定化に機能未知因子「ＹａｂＪ」が関わっている可能性が高まっている。そこで、ＹａｂＪの強制発現株や共発現株を作製した後、これらを応用してＰＧＡ増産研究に資するインビボ試験系の革新を目指す。また、これらの機能や発現量を減衰させる仕組みや変異株を組み合わせる試みもあわせて進める。いわゆる正負の方向性を意識した二重分析で「ＹａｂＪ」の実像／機能を浮き彫りにすることで、当該増産機能の理解深化を図る。
②Ｃａｐ_5’-ＵＴＲ配列のレアアース認識能分析：全１７種のランタノイドを対象とする予備試験から、上述の分子相互作用はＤｙ特異的な現象である可能性が強く示唆された。そこで、他のランタノイドを共存させてもＤｙ認識能に変化がないかどうか調べる。非常によく似た性質のランタノイドを分離するケモ技術を確立されるまでにほぼ一世紀を要したが、今もなお、特定のレアアースのみを迅速に検出同定するための技術や材料を生み出すまでには到っていない。そのため、ここで期待される成果を起点に、レアアースバイオテクノロジーに資する（これまでにないタイプの）ＤＮＡ材料の設計合成が進展するものと期待される。
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