2018 Fiscal Year Annual Research Report
Identification of RARgamma-activated muscle hypertrophic factor and its regulatory mechanism
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17H03820
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
山地 亮一 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (00244666)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ビタミンA / β-カロテン / レチノイン酸受容体 / 筋管細胞 / 骨格筋 / トランスグルタミナーゼ2 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
転写因子であるレチノイン酸受容体（RAR）はビタミンA（ATRA）をリガンドとして活性化する。ビタミンA前駆体のβ-カロテンを摂取したマウスでは、RARアイソフォームのRARγの活性化を介して骨格筋が肥大（筋量が増加）し、筋力も増加することを発見したが、RARγを介して筋肥大が起こる詳細な分子機構は不明である。今年度はRARγの制御下にある筋肥大誘導因子を同定し、その分子機構を解明することを目的とした。筋肥大誘導因子に関してはRARγに依存して発現が増加し、分泌されるタンパク質がオートクライン的に筋肥大を誘発するとの仮説を立て、まずATRAに応答する遺伝子をRNA-seqにより網羅的に解析し、3倍以上発現が増加した遺伝子を細胞内外のプロテオームのナレッジベースであるMetazSecKBを利用して解析することで分泌タンパク質の候補としてATRAで最も発現レベルの変動するtransglutaminase 2（TGM2）に注目した。TGM2はβ-カロテンを摂取したマウスのヒラメ筋で発現が増加したが、RARγをノックダウンしたヒラメ筋ではβ-カロテン摂取によるTGM2の発現上昇は抑制された。さらに組み換えTGM2を野生型（Wt-rTGM2）と活性を欠失した変異型（Mut-rTGM2）の２種作製し、各rTGM2存在下で筋管細胞を培養したところ、どちらのrTGM2でも筋管細胞が肥大化した。Wt-rTGM2と同様にMut-rTGM2は筋管細胞におけるタンパク質合成の促進とmTORシグナル因子の活性化を誘発したが、GPCRの一種であるGPR56の発現をノックダウンするとそれらの誘発は消失した。またTGM2による筋管細胞の肥大もGPR56をノックダウンすると抑制された。これらの結果からTGM2はGPR56を介してmTORシグナルを活性化し、タンパク質合成と筋肥大を誘発することが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
β-カロテンを摂取することでヒラメ筋が肥大し、筋量が増加することを見出し、その分子機構について検討した。筋肥大に関してはATRAに応答して発現の増加する分泌タンパク質がオートクライン的に骨格筋を肥大化させるとの仮説を立て、ATRA応答遺伝子をRNA-seqにより網羅的に解析し、その後細胞内外のプロテオームのナレッジベースであるMetazSecKBで解析し、TGM2に注目した。TGM2が細胞外に分泌されることを証明し、さらに組換えTGM2を作製し、TGM2が酵素活性非依存的に筋管細胞を肥大化させ、またmTORシグナルを活性化してタンパク質合成を促進させることを証明した。さらにTGM2による筋肥大には細胞膜の受容体であるGPR56が関与していることを突き止め、RARγによる筋肥大誘発機構におけるTGM2の関与とTGM2による筋肥大誘発機構における情報を得ることができ、順調に進んでいるといえる。一方で、今年度骨格筋でRARγを高発現するマウスを作製してRARγの筋肥大における役割の検討する予定であったが、骨格筋でのRARγの発現が低く、現在条件を検討中である。
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| Strategy for Future Research Activity |
GPR56を介したTGM2による筋肥大を促進する詳細な分子機構について検討するとともに、GPR56とTGM2が相互作用するとGPR56の構造あるいは細胞膜表面における局在に影響があるのか、また互いのどの領域を相互作用するのに必要とするのかという物理的な解析も行う。さらに人工的に分泌型となる組み換えTGM2を作製し、分泌後にTGM2がGPR56を介して筋肥大することをまずin vitro系で評価する。その後、in vivoにおける評価として、アデノ随伴ウィルスを利用してこの分泌型の組み換えTGM2をマウスの後肢筋で高発現させ、実際に筋肥大を誘発するのか、またin vitroで見出したシグナル伝達系が活性化されているのかを評価することで、分泌されたTGM2の筋肥大機能を証明する。またTGM2によって筋肥大した筋肉が筋力の増加をともなっているのかも合わせて評価する。さらにTGM2のプロモーター領域を解析することで直接RARγによって発現制御されているのかを評価するとともに、RARγのプロモーター領域も解析することでRARγの発現調節機構も明らかにする。一方、筋管細胞においてβ-カロテンがCD36を介して細胞内に取り込まれた後に細胞質以外に核内でも存在することを見出したので、β-カロテン自体がRARγのリガンドとなりうるのかも検討するため、大腸菌でβ-カロテン存在下で組み換えRARγを発現させ、精製し、結合を評価する。
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