Development of methodology using environmental DNA to monitor insect pathogens of forest defoliating insects

2020 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H03826
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 鎌田 直人 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (90303255)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2021-03-31
• Keywords: ブナ林 / 土壌 / 菌類 / メタゲノム解析 / 空間異質性 / 次世代シーケンス / OTU数 / リン酸バッファー

Outline of Annual Research Achievements

土壌中の菌類群集は空間的異質性が高いため、メタゲノム解析など、解析に使用したサンプルについては正確な解析ができても、木を見て森を見ずということになりかねない。そこで、1サンプル量を増やすことによって、この問題を解決できないか、手法を模索してきた。ひとつのブナ林の林分の中に、互いに10m以上離れた4つのプロットを設定し、各プロットからは互いに50cm以上離れた4サンプルを採集した。土壌の腐植酸がDNAの抽出効率に影響を与えることが知られているため、腐植酸を含む土壌からのDNA抽出に優れているMACHERY-NAGAL社のNucleoSpinSoilを使いマニュアルに従い1サンプルあたり約5gの土壌を用いて抽出したDNAサンプル、リン酸バッファー法と溶解バッファー法で、1サンプルあたり約15gの土壌を用いて抽出したDNAサンプルを、次世代シーケンサー（Miseq）でシーケンスを行った結果を解析した。その結果、総リード数の2%以上のリード数であったメジャー種については、１OTUを除き3つの方法の間で差はみられなかった。しかし、それ以下のマイナー種では、3つの手法の間で差が認められた。溶解バッファー法では、マイナー種のOTU数が他の２方法に比べて有意に少なくなった。一方で、リン酸バッファー法では総OTU数が市販キットよりも有意に多かった。これらの結果は、溶解バッファー法でDNA抽出に使う土壌サンプル量を3倍に増やしたことにより、多くの菌種をよりも裏的に補足できた可能性を示している。

Research Progress Status

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

令和2年度が最終年度であるため、記入しない。