2017 Fiscal Year Annual Research Report
The build-up study on the functionality of medicinal mushroom Ganoderma lingzhi based on Japanese genomic editing technology
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17H03845
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
清水 邦義 九州大学, 農学研究院, 准教授 (20346836)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
中村 崇裕 九州大学, 農学研究院, 准教授 (10464398)
大貫 宏一郎 近畿大学, 産業理工学部, 准教授 (50378668)
松本 雅記 九州大学, 生体防御医学研究所, 准教授 (60380531)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 霊芝 / ゲノム編集 / トリテルペノイド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
霊芝キノコのゲノム編集について、霊芝特異的プロモーターの単離、ターミネーターの単離、霊芝ゲノム編集用ベクターの構築等の実験を行ってきた。その中で、ゲノム編集に用いるプロトプラストの遺伝子導入効率の低さと、遺伝子発現効率の低さは新規キノコ作成において、ボトルネックとなっていた。この状況に変化をもたらしたのは、刑部らのキノコゲノム編集に関する論文であった（Scientific Reports (2017)。これまで、ある一定の形質を有するプロトプラストを用いると効率が上がることが判明していた。よって我々は、霊芝プロトプラストを用いたゲノム編集には、菌糸体を用いた予備的実験の中で、細胞融合・ゲノム編集を効率的に行うためには扱い易いプロトプラストの採取が必須という結論に至り、セルソーターにより最適なプロトプラスト採取の条件を探索している。我々はこれまでに、霊芝子実体の有用成分のLC/MSを用いた網羅的解析技術を確立しており、新規の菌糸体の作成に成功すれば霊芝トリテルペノイドの数十種類を同時に同定できるシステムを構築している。
また、我々はこれまでに、ゲノム編集に必要なプロモーター、ターゲット遺伝子（コーデイングシーケンス）、ターミネーター領域のDNAを霊芝特異的遺伝子としてPCR法により探索し、有望領域を決定した。ターゲット遺伝子としてP450遺伝子群のコーディング領域をゲノム編集している。但し、これらの遺伝子セットが実際に作動するかは未定であるのでキノコゲノム編集で使用された遺伝子も併せて探索している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまで、当研究室は、キノコプロトプラストの細胞融合法による品種改良には有る特定の形質のプロトプラストを用いると効率が上がることが判明していた。さらに、このキノコゲノム編集の論文から、有る特定の形質を有するプロトプラストは遺伝導入効率が高いという結果を論文データは示していた。よって我々は、霊芝プロトプラストを用いたゲノム編集には、菌糸体を用いた予備的実験の中で、細胞融合・ゲノム編集を効率的に行うためには扱い易いプロトプラストの採取が必須という結論に至った。また、これまでの我々の予備的実験より有る特定の形質を有するプロトプラストは品種改良し易いことが判明している（未発表データ）。
また、我々はこれまでに、霊芝子実体の有用成分のLC/MSを用いた網羅的解析技術を確立しており、新規の菌糸体の作成に成功すれば霊芝トリテルペノイドの数十種類を同時に同定できるシステムを構築している。
ゲノム編集に必要なプロモーター、ターゲット遺伝子（コーデイングシーケンス）、ターミネーター領域のDNAを日本九州産の霊芝特異的遺伝子としてPCR法により探索してきた。その結果、プロモーター、ターミネーター、ターゲット遺伝子を決定し、それらの情報を元に、ゲノム編集している。但し、これらの遺伝子セットが実際に作動するかは未定であるのでキノコゲノム編集で使用された遺伝子群についても併せて探索している。ゲノム編集に使用する発現システムはGreen gate法を用い、ゲノム編集はPPRタンパク質を用いた方法により行っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
我々はこれまでに、霊芝キノコのゲノム編集について、霊芝特異的プロモーターの単離、ターミネーターの単離、霊芝ゲノム編集用ベクターの構築等の実験を行ってきた。その中で、ゲノム編集に用いるプロトプラストの遺伝子導入効率の低さと、遺伝子発現効率の低さは新規キノコ作成において、ボトルネックとなっていた。霊芝キノコの菌糸体を用いた予備的実験の中で、細胞融合・ゲノム編集を効率的に行うためには扱い易いプロトプラストの採取が必須という結論に至った。従って、この研究の当面の課題は、「特定の形質を有するプロトプラストは細胞融合・ゲノム編集し易いのか？」を明らかにすることである。
３０年度以降は、セルソーターと、次世代シーケンサーを使用して目的とするプロトプラストの絞り込みと同定を行う。プロトプラストは一般的に液体培養菌糸体から酵素処理により分離・精製する方法が一般的であるが、得られたプロトプラストの性状・分子情報はほとんどなく、これまで、性状未知のプロトプラストを用いて、品種改良や遺伝子導入法による新規菌株作成が行われてきた。これまでの方法では、新規菌糸体作出率が極めて低く、作出には高度な技術を必要としてきた。そこで、性状が全く解っていないプロトプラストの分類をセルソーター（現有設備）と次世代シーケンサー（現有設備）によるmRNA発現プロファイルで行う。有用な性状を呈するプロトプラストを形態学的に、発現分子と組み合わせて選別し、ゲノム編集などに適したプロトプラストを同定する。
また、我々はこれまでに、霊芝子実体の有用成分のLC/MSを用いた網羅的解析技術を確立しており、新規の菌糸体の作成に成功すれば霊芝トリテルペノイドの数十種類を同時に同定できるシステムを構築しているため、本系を用いて、ゲノム編集後の霊芝の成分変化を検討する。
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