2017 Fiscal Year Annual Research Report
Hormonal regulation of membrane transport proteins involved in acclimation of fishes to fresh water and seawater
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17H03870
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
加藤 明 東京工業大学, バイオ研究基盤支援総合センター, 准教授 (40311336)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | イオン輸送体 / 淡水魚 / 海水魚 / 腎臓 / エラ / 受容体 / 細胞内シグナル伝達 / 電気生理学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
真骨魚のエラ，腸，腎臓に発現する様々な膜輸送体（トランスポーター，チャネル，ポンプ）を同定して機能を明らかにした結果，淡水・海水順応における水電解質代謝を分子レベルで説明できるようになりつつある。エラ，腸，腎臓の機能は様々なホルモンにより制御されるが，プロラクチン・コルチゾールを始め淡水・海水順応を制御するとされるホルモンが膜輸送体を制御する機序は明らかでない。我々はこれまでアフリカツメガエル卵母細胞に発現させた膜輸送体を電気生理学的に測定する優れたシステムを構築してきたが，本年度，装置の機能を拡張した。その結果，膜電位を固定した状態で膜電流を測定しながら同時に細胞内イオン活性を測定するシステムの構築に成功した。このシステムを微小Mg2+電極，Na+電極，H+電極，Cl-電極などと組み合わせることで，起電性イオン輸送体の活性測定をより高感度に行うことが可能になる。得られた装置の稼働率を上げてホルモン効果機としての膜輸送体の機能を効率よく解析し、魚類の淡水・海水順応を担う受容体と輸送体の分子相関をin vitroで解析する国際研究ハブを本申請により構築することを目指す。特に海水魚腎臓によるMg2+，SO42-，ホウ酸排出を担うと考えられている2Na+/Mg2+交換輸送体，Cl-/SO42-交換輸送体，2HCO3-/SO42-交換輸送体，ホウ酸輸送体などの活性を促進もしくは抑制するシグナルを明らかにする。また淡水エラによるNaCl吸収，腎臓によるNaCl再吸収を担うNa+/H+(NH4+)交換輸送体，Na+/Cl-共輸送体の制御や，新たに発見したK+/H+交換輸送体の活性を制御するシグナルの解析も推進する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2Na+/Mg2+交換輸送体の活性を制御する情報伝達系の解析：これまでの研究から広塩性フグのメフグを海水順応させるとMg2+輸送体として知られるCnnm3とSlc41a1の腎臓における発現が上昇し，淡水順応させると腎臓におけるCnnm2の発現が上昇する事を見出している。これらのアフリカツメガエル卵母細胞に発現し，細胞膜におけるMg2+及びNa+輸送活性をMg2+電極及びNa+電極により評価した。Mg2+電極を用いた解析は新しい技術であり，細胞内Mg2+活性を安定的に測定する条件検討を行い，比較的良好な実験条件の開発に成功した。Cnnm3は細胞膜上に安定的に発現するが，その活性について結論を出すにはさらなる解析が必要な状況となっている。また卵母細胞に発現させたSlc41a1は細胞内膜に局在する。活性を解析のため，Slc41a1を細胞膜上へ移行させる細胞内シグナル因子の探索を進めている。
新たなホウ酸輸送体の同定：これまでの解析によりアポリン（AQP）ファミリーのなかでAQP3, AQP7, AQP8がホウ酸輸送活性を有することを明らかにしてきたが，さらなる網羅的な活性解析の結果，AQP9もホウ酸を輸送することが明らかとなった。微小H+電極を用いた電気生理学的な活性解析から，AQP9は他のアクアポリンファミリー同様，非イオン型ホウ酸を輸送することが明らかとなった。
K+/H+交換輸送体の活性解析：淡水魚エラに発現するK+/H+交換輸送体を同定し，卵母細胞における安定した発現系を得ている。微小H+電極を用いてK+以外の陽イオンに対する輸送活性を解析し，新たな知見を得ることに成功した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2Na+/Mg2+交換輸送体の活性を制御する情報伝達系の解析：CnnmファミリーやSlc41ファミリーを発現させた卵母細胞，もしくはこれら2つのファミリーを共発現させた卵母細胞におけるMg2+輸送活性の測定を微小Mg2+電極を用いて継続して行う。またMg2+輸送活性を促進するシグナル因子（リン酸化・脱輪酸化酵素，脱ユビキチン化酵素など）の探索も継続して行う。
淡水魚エラによるNa+吸収，腎臓によるNaCl再吸収を担う輸送体の制御機構の解明：淡水魚エラに発現するNa+/H+(NH4+)交換輸送体とアンモニアチャネルRhcg1，炭酸脱水酵素，足場タンパク質などを共発現させ，Na+輸送活性を大きく促進するメカニズムを探索する。またNa+/H+(NH4+)交換輸送体の活性制御に関わるシグナルの解析を行う。腎臓に発現するNa+/Cl-共輸送体の活性解析系を確立し，プロラクチンシグナル，GPCRシグナル，キナーゼ，脱ユビキチン化酵素などが活性に及ぼす影響を評価し，NaCl再吸収の制御機構を明らかにする。
魚類の海水適応を担う輸送体活性の制御機構の解析：海水魚エラでCl-排出を担うCl-チャネルとして知られるCFTRの良好な発現系を既に得ている。CFTRの活性制御に哺乳動物と魚類とで異なる性質を見出しており，その違いを明らかにする。また腎臓におけるSO42-排出を担うCl-/SO42-交換輸送体，HCO3-/SO42-交換輸送体の活性解析とその活性化に関わる因子の探索を行う。また海水魚腎臓のホウ酸排出を担う非イオン型ホウ酸チャネル及びホウ酸イオンチャネルの活性測定を行い，それらの活性を促進もしくは抑制する因子を探索する。
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