2018 Fiscal Year Annual Research Report
Hormonal regulation of membrane transport proteins involved in acclimation of fishes to fresh water and seawater
| Project/Area Number |
17H03870
|
|---|
| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
|---|
Principal Investigator |
加藤 明 東京工業大学, バイオ研究基盤支援総合センター, 准教授 (40311336)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 魚類生理学 / イオントランスポーター / ホルモン受容体 / 輸送上皮細胞 / 淡水・海水適応 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
真骨魚のエラ，腸，腎臓に発現する様々な膜輸送体（トランスポーター，チャネル，ポンプ）を同定して機能を明らかにした結果，淡水・海水順応における水電解質代謝を分子レベルで説明できるようになりつつある。エラ，腸，腎臓の機能は様々なホルモンにより制御されるが，プロラクチン・コルチゾールを始め淡水・海水順応を制御するとされるホルモンが膜輸送体を制御する機序は明らかでない。我々はこれまでに，アフリカツメガエル卵母細胞に発現させた膜輸送体を電気生理学的に測定する優れたシステムの構築に成功し，年間を通して安定的に，様々な輸送体活性とその制御を解析する体制を構築した。膜電位を固定した状態で膜電流を測定しながら同時に細胞内イオン活性を測定するシステムを微小Mg2+電極，Na+電極，H+電極，K+電極，Cl-電極などと組み合わせることで，起電性イオン輸送体の活性測定をより高感度に行うことが可能となる。得られた装置の稼働率を上げてホルモン効果機としての膜輸送体の機能を効率よく解析し、魚類の淡水・海水順応を担う受容体と輸送体の分子相関をin vitroで解析する国際研究ハブを本申請により構築することを目指す。特に海水魚腎臓によるMg2+，SO42-，ホウ酸排出を担うと考えられている2Na+/Mg2+交換輸送体，Cl-/SO42-交換輸送体，2HCO3-/SO42-交換輸送体，ホウ酸輸送体などの活性を促進もしくは抑制するシグナルを明らかにする。また淡水エラによるNaCl吸収，腎臓によるNaCl再吸収を担うNa+/H+(NH4+)交換輸送体，Na+/Cl-共輸送体の制御や，新たに発見したK+/H+交換輸送体の活性を制御するシグナルの解析も推進する。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2Na+/Mg2+交換輸送体ファミリーCnnmの活性を制御する情報伝達系の解析：これまでの研究から広塩性フグを海水順応させると腎臓におけるCnnm3の発現が上昇し，淡水順応させるとCnnm2の発現が上昇する事を見出している。すなわちCnnm3はMg2+の尿細管分泌に，Cnnm2はMg2+の再吸収に働くと考えられる。またCnnm4は淡水メフグと海水メフグ腎臓に同レベルに高発現しているため，Mg2+ホメオスタシスにおける役割が明らかでない。本年度はNa+電極やMg2+電極を用いた活性評価系を構築し，活性を制御する可能性のある脱ユビキチン化酵素などについて解析を進めた。淡水魚のNa+吸収を担うエラNa+/H+交換輸送（Nhe3）の制御機構の解明：Nhe3は淡水魚エラを介したNa+吸収を担う輸送体として知られ，その活性を評価するシステムを既に得ている。Nhe3の活性を制御し得る他の輸送体，酵素，ホルモン受容体の発現系を構築し，共発現による活性変化を解析している。AQPファミリーによるホウ酸輸送活性の解析：トラフグAQPファミリーの網羅的な活性解析からB(OH)3チャネル活性を有するAQPを特定した。Swelling assayや電気生理学を用いた特性解析がほぼ完了した。K+/H+交換輸送体の活性解析：淡水魚エラに発現するK+/H+交換輸送体を同定し，卵母細胞における安定した発現系を得ている。微小H+電極に加えてK+電極を用いた活性解析法を構築し活性測定に成功した。海水魚集合管に発現する膜輸送体の発現解析：ゲノム支援によるRNA-Seq解析支援により，トラフグ集合管に発現する膜輸送体とホルモン受容体の網羅的解析に成功し，海水魚集合管における水電解質の再吸収機構の新たなモデルを構築した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
2Na+/Mg2+交換輸送体ファミリーCnnmの活性を制御する情報伝達系の解析：海水魚腎臓によるMg2+排出や淡水魚腎臓によるMg2+再吸収の分子メカニズムを明らかにするためXenopus oocyteに発現させたMg2+輸送体の活性をMg2+電極により測定する手法の開発を進め，Mg2+輸送体の活性を促進する因子の探索を継続する。淡水魚のNa+吸収を担うエラNa+/H+交換輸送（Nhe3）の制御機構の解明：Xenopus oocyteにNhe3と他の因子を様々な組合せで共発現させて電気生理学により活性を定量評価し，エラを介したNa+吸収の制御システムを明らかにする。淡水魚の水排出を担う腎NaCl共輸送体（Ncc）の制御機構の解明：NaCl共輸送体（Ncc, Slc12a3）は淡水魚腎臓に高発現し，尿の希釈や水の排出に寄与していると考えられている。Xenopus oocyte に発現させたNcc の活性をNa+電極やCl-電極を用いて評価するシステムを確立し，共発現系の解析からNcc活性を促進もしくは抑制するホルモン、キナーゼなどの情報伝達システムの同定を試みる。特に魚類の淡水適応に重要とされる下垂体ホルモンのプロラクチン、及びプロラクチン受容体の役割を明らかにする。海水魚集合管に発現する膜輸送体の解析：トラフグ集合管に発現する膜輸送体とホルモン受容体のXenopus oocyteにおける発現系を構築し，海水魚集合管におけるNa+, K+, Cl+, H2O輸送機構とその制御を解析する。重要な因子についてはポリクローナル抗体を作製して腎組織の免疫組織染色を行い，細胞内局在を明らかにする。
|
