2017 Fiscal Year Annual Research Report
Development of host strains for the production of gametes through germline chimera in marine fish
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17H03873
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
後藤 理恵 (風藤理恵) 愛媛大学, 南予水産研究センター, 准教授 (70399997)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松原 孝博 愛媛大学, 南予水産研究センター, 教授 (60443389)
斎藤 大樹 愛媛大学, 南予水産研究センター, 准教授(特定教員) (90396309)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | スマ / tyrosinase / slc24a5 / dead end / ゲノム編集 / 始原生殖細胞 / 不妊化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、生殖系列キメラを用いたスマの配偶子生産システム構築に向けて、借腹生産に不可欠な宿主開発を行う。宿主には、個体およびDNAレベルで簡便かつ確実に判別するために、野生型とは異なる体色をベースに持ち、不妊形質を付加した系統の作出を最終ゴールと位置付ける。H29年度は、Platinum TALENを用い、体色関連遺伝子tyrosinase (tyr)及びSLC24a5を編集したスマ仔魚を作出し、解析及び継続飼育を実施した。いずれの変異体においても、網膜色素上皮や体側のメラニン色素の欠損または減少が認められた。これら変異体におけるtyr及びslc24a5の遺伝子発現を調べたところ、有意に減少していた。変異体の継続飼育を試みた結果、孵化後１１日以降の生残は確認されなかった。この原因として、初期の生物餌料に対する視認性が低いことが考えられた。次に、不妊化誘導のための分子ツールとして、スマ生殖腺から単離したdead end (dnd)遺伝子に対するモルフォリノオリゴを作成し、本遺伝子の発現抑制により不妊化が誘導可能かを検証した。受精卵へ始原生殖細胞（PGCs）を可視化するGFP-nanos RNAとdndモルフォリノオリゴを共注入し、孵化後5日齢の仔魚におけるPGCsの欠損率を調べたところ、ほとんどの個体でPGCsが欠損していた。また、不妊化個体を継続飼育し、２ヶ月半齢の生殖腺を調べたところ、生殖腺の中に生殖細胞が認められなかった。これにより、dnd遺伝子の発現抑制によりスマを不妊化誘導できることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
体色関連遺伝子の変異体の継続飼育においては、初期の生物餌料の不適合性が考えられたため、飼育方法の検証を行う必要がある。また、変異体そのものの生残性が低いことも考えられることから、他の体色関連遺伝子の変異体についても検証する予定である。不妊化については、dnd遺伝子の発現抑制により誘導が可能であることがが明らかになったため、さらに検体数を増やし解析するとともに、CRISPR/Cas9を用いた変異体誘導を行い、その表現型を調べる予定である。また、他の不妊化候補遺伝子についても引き続き探索を行う予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究は、ゲノム編集技術を用い、スマの不妊化系統を作出することを最終目標としている。不妊化誘導可能な遺伝子の選定を進めるとともに、系統維持のための最適な方法を模索していく予定である。スマは季節産卵する繁殖形態であり、さらに通常は産卵までに２年かかる魚種であるため、研究を円滑に進めるために、基礎的なデータの収集にはゼブラフィッシュも利用しながら進めている。
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