2019 Fiscal Year Annual Research Report
Development of host strains for the production of gametes through germline chimera in marine fish
| Project/Area Number |
17H03873
|
|---|
| Research Institution | Ehime University |
|---|
Principal Investigator |
後藤 理恵 (風藤理恵) 愛媛大学, 南予水産研究センター, 准教授 (70399997)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松原 孝博 愛媛大学, 南予水産研究センター, 教授 (60443389)
斎藤 大樹 愛媛大学, 南予水産研究センター, 准教授(特定教員) (90396309)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 借腹生産 / スマ / 不妊化 / 生殖細胞 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は海産魚の借腹生産における宿主開発として、宿主の不妊化技術開発を行っている。宿主の不妊化は移植するドナー由来の配偶子を効率的に得るために必要な技術である。我々研究グループはこれまで多くの魚種の不妊化技術を開発してきている。その中で、初期の生殖細胞、始原生殖細胞に特異的に発現するdead end(dnd)遺伝子の発現抑制が効率良く宿主の不妊化を誘導できることを明らかにした。本研究においても、スマのdnd遺伝子に対するモルフォリノオリゴヌクレオチドを導入することにより不妊化を誘導できることを確かめた。しかし、近年養殖魚として系統を確立しつつあるスマでは、dnd遺伝子のモルフォリノオリゴヌクレオチド標的配列中に複数の遺伝子多型が存在することが明らかになった。そのため、個々の多型に合わせたモルフォリノオリゴヌクレオチドを導入する必要が生じた。しかし、種内の一塩基多型（SNP）を考慮する必要のある遺伝子発現抑制法では、系統化の進んでいない魚種、特に海産養殖魚においては実用的ではないと考えられた。そこで、遺伝子配列を利用する不妊化法ではなく、タンパク質の強制発現による不妊化法の開発を行うことにした。初期胚発生期に発現する既知遺伝子sdf1a遺伝子は始原生殖細胞が移動するルート上の体細胞に発現している。始原生殖細胞の細胞膜ではsdf1a遺伝子の受容体であるcxcr４遺伝子が発現し、SDF１a遺伝子の濃度勾配により誘導され、生殖腺形成領域まで移動することが知られている。このsdf1a遺伝子にnanos3遺伝子を連結したプラスミドを構築し、そのRNAを1-4細胞期のスマ卵に導入したところ、受精後11日令のスマにおいて約８割の生殖細胞を欠損させることができた。今後は生殖細胞欠損効率を高めるため、RNA導入方法やsdf1a遺伝子発現方法などを検討する予定である。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では海産魚スマの借腹生産における宿主開発を目的とし、ゲノム編集による体色関連遺伝子の改変及び不妊化系統の作出を進めてきた。体色関連遺伝子としてslc24a5及びtyrosinaseを改変したスマを作出し、ファウンダーの長期飼育を試みた。このファウンダーを現有の30t陸上水槽で飼育したが突進遊泳が原因で数ヶ月齢までしか飼育できず、親魚を得ることができていない。現時点では、ゲノム編集魚の飼育管理は閉鎖系が前提となるため飼育環境の改善が必須である。そのため、狭い水槽でもゲノム編集魚を飼育可能な飼育技術開発を同時に進めている。また、ゲノム編集を実施する上では、標的とする遺伝子の遺伝的多型（SNP）を考慮する必要が生じた。そのため、親魚候補魚のSNPの把握、特定のSNPをもつ親魚選別及び管理等を事前に実施した上で実験を継続する予定である。一方、SNPに対応した親魚管理を前提とした不妊化法は、種ごとまたは系統ごとに開発する必要があり、より汎用性の高い不妊化法の開発も必要になった。今年度は、ゲノム改変を伴わず、SNPにも左右されない不妊化誘導法として、タンパク質強制発現による不妊化誘導技術に重点をおいて実験した結果、スマで一定の成果を得ることができた。このことから、当初計画にはなかった実験が生じているが、海産魚の宿主開発としては新たな知見が得られており、本研究はおおむね順調に進展していると判断した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
現在開発中のsdf1a遺伝子を用いた不妊化誘導法では、孵化仔魚の段階で約８割の生殖細胞を減少させることができた。このため、低妊性宿主として、ドナー生殖細胞の配偶子形成への寄与率の向上が期待できる。しかし、コイ科魚類では初期生殖腺にわずかに存在する生殖細胞からも正常な配偶子が形成されることが報告されていることから、可能な限り宿主由来の生殖細胞をなくす事が望ましい。そこで、最終年度はsdf1a-nanos3コンストラクトを用い、受精卵への導入時期やsdf1a遺伝子の発現誘導方法の改善などを検討していく予定である。本手法は、他魚種においても同様の効果を得られる可能性があり、汎用性のある不妊化宿主開発として、他の海産魚での検証も進める予定である。ゲノム編集を用いた宿主開発については、１．SNPに対応した親魚選抜、２．現有の３０t水槽での長期飼育に向けた飼育改善、３．ゲノム編集魚の作出及び長期飼育を行う予定である。また、初期胚や生殖腺における遺伝子の探索を行い、不妊化に有用な候補遺伝子の探索を継続する予定である。
|
-
-
[Journal Article] Targeted mutagenesisof the ryanodine receptor by Platinum TALENs causes slow swimming behaviour in Pacific bluefin tuna (Thunnus orientalis)2019
Author(s)
Kentaro Higuchi, Yukinori Kazeto, Yuichi Ozaki, Toshiya Yamaguchi, Yukinori Shimada, Yoshiaki Ina, Satoshi Soma, Yoshitaka Sakakura, Rie Goto, Takahiro Matsubara, et. al
-
Journal Title
Scientific Reports
Volume: 9
Pages: 13871
Peer Reviewed / Open Access
-
-
-
