2017 Fiscal Year Annual Research Report
脂質分布ナノスケール解析技術確立による生体膜脂質トポロジー形成の生物学的意義解明
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17H03935
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
藤田 秋一 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 教授 (60282232)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
叶内 宏明 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 准教授 (10351884)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | イノシトールリン脂質 / 電子顕微鏡 / 微細局在 / 急速凍結 / フリーズ・フラクチャー / オートファゴソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
酵母細胞でのホスファチジルイノシトール４リン酸（PtdIns(4)P）を標識する技術を開発し，哺乳類培養細胞におけるオートファゴソームでのPtdIns(4)Pのナノスケールでの分布解析を行った．哺乳類培養細胞には，Huh7細胞を用いた．オートファジーの誘導には，オートファゴソームと後期エンドソームの融合を抑制するBafilomycin A1存在下に，オートファジー誘導を制御しているmTOR蛋白質の抑制剤であるTorin1を処置することにより行なった．Bafilomycin A1存在下にTorin1を処置することにより，オートファジー誘導のマーカーであるLC3の発現が有意に促進されていることがわかる．Torin1とBafilomycin A1処置Huh7細胞を急速凍結し，細胞のレプリカを電子顕微鏡で観察すると，オートファゴソームの特徴である膜内粒子のない二重膜が多数観察された．抗PtdIns(4)P抗体で標識すると，オートファゴソームの二重膜のうち， 内膜，外膜共に内葉（細胞質側）にPtdIns(4)Pが局在することがわかった．また，オートファゴソームのマーカーであるLC3B, GABARAPL1, GABARAPL2, Rab7との二重標識を行った．LC3B, GABARAPL1, GABARAPL2およびRab7はPtdIns(4)Pと同様にオートファゴソームの外膜，内膜共に内葉に局在が確認できた．しかしながら，予想に反し，PtdIns(4)Pの標識はLC3B，GABALAPL1およびGABALAPL2とは共局在しなかった．これに反し，Rab7の標識はPtdIns(4)Pとオートファゴソーム上で共局在した．Rab7はオートファゴソームの形成の後期に局在することが知られており，PtdIns(4)Pはオートファゴソームの形成後期に発現することが示唆された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
イノシトールリン脂質のPtdIns(4)Pを標識し，哺乳類細胞のオートファゴソームでの微細局在について検討を行うことができた．
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| Strategy for Future Research Activity |
ホスファチジルセリンやコレステロールなど，他の脂質の標識プローブを作成し，哺乳類培養細胞の細胞膜や細胞内小器官の生体膜での微細局在を検討する方法の確立を進める．
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