Production of genetically modified pigs by combined techniques of chromosome engineering and genome editing

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H03938
• Research Institution: The University of Tokushima
• Principal Investigator: 音井 威重 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 教授 (30311814)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 竹本 龍也 徳島大学, 先端酵素学研究所(オープンイノベ), 教授 (30443899) ; 香月 康宏 鳥取大学, 医学(系)研究科(研究院), 准教授 (90403401) ; 谷原 史倫 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 特任助教 (90754680)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 人工染色体 / ゲノム編集 / ブタ / 異種移植

Outline of Annual Research Achievements

近年、ドナー不足を解消する手段としてブタの臓器・組織を用いる異種移植に関心が高まっている。しかし、移植後１週目以降の急性・慢性拒絶反応による臓器機能不全を克服しなければならない大きな課題がある。本研究は、遺伝子搭載サイズに制限がない人工染色体技術と、任意のゲノムを部位特異的に切断し変異を挿入（ノックアウト）できるゲノム編集技術を組み合わせて、拒絶反応の少ない異種移植用の遺伝子改変ブタを作製することを目的とした。実際には、日本人に多いヒトHLA A24遺伝子を人工染色体で挿入し、かつ異種抗原であるGal転移酵素遺伝子をノックアウトすることにより、拒絶反応の少ない異種移植用のHLA 挿入GalT-KO ブタを作出する。本年度は、抗原関連遺伝子（GalT）を標的としたCRISPR-Cas9システムの構築（guide RNAの設計）を行い、設計したguide RNA(gRNA)の遺伝子改変効率をブタの体外受精胚を用いて確認し、高効率なgRNAを用いて遺伝子改変ブタの作製を試みた。その結果、効率のよい2種類のgRNAの設計が判明し、両gRNAは胚盤胞の形成率に影響しないことも確認できたため、胚移植により高効率にGalTノックアウトブタを作製することが期待できるようになった。一方、ブタ胎仔から採取した繊維芽細胞に人工染色体ベクターを微小核細胞融合法を用いて導入したところ、5クローンの薬剤耐性クローンが獲得できた。しかし、増殖性がみられたクローンについて、ブタの内在染色体異常がみられたため、追加のクローンの取得を目指すこととなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

CRISPR/Cas9システムを用いてGalT遺伝子をノックアウトするための効率のよい2種類のgRNAの設計が判明した。両gRNAは胚盤胞の形成率に影響しないことも確認できたため、胚移植により高効率にGalTノックアウトブタを作製することが期待できるようになった。現在、判明した2種類のgRNAを用いてゲノム編集胚を作製後、受胚ブタに胚移植を行い、GalTノックアウトブタの作製を試みたが(2頭移植)、妊娠には至っていない。人工染色体ベクターをブタ線維芽細胞に微小核細胞融合法を用いて導入したところ、5クローンの薬剤耐性クローンが獲得できた。5クローンのうち、増殖性がみられた1クローンについて、FISH解析を行ったところ、ブタ染色体に転座することなく独立に人工染色体ベクターが1本存在することを確認できた。しかし、ブタの内在染色体異常がみられたため、今後は追加のクローンを取得して解析を進める予定である。

Strategy for Future Research Activity

前年度に引き続き、変異導入率の高い2種類のｇRNAを候補に、他のｇRNAとの組み合わせも検討したのちに、様々な組み合わせのｇRNAでGalT遺伝子のゲノム編集した胚を発情同期化したレシピエント雌豚に移植し、GalTノックアウトブタを作製する。次に、GalTノックアウトブタにおけるGal抗原の有無およびオフターゲットを評価し、最適のgRNAを確定する。人工染色体については、前年度に検討した、ブタ線維芽細胞を用い、正常な内在染色体をもつクローンの取得を目指す。クローン取得後は、受容細胞をドナー核として用いて体細胞クローン胚を作製し、GalTノックアウトのための最適な電圧、通電時間、電圧パルスの回数・波形条件を基に、設定した条件でのクローン胚発育率等を検討し、GEEP法の最適条件を確立する。