2017 Fiscal Year Annual Research Report
性決定カスケードとエクダイソンシグナルのクロストークによる性分化機構の解明
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17H03940
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
鈴木 雅京 東京大学, 大学院新領域創成科学研究科, 准教授 (30360572)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 性決定 / 性分化 / 昆虫 / エクダイソン / カイコ / ホルモン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、一般に昆虫の脱皮・変態に関わることが知られるエクダイソンが、昆虫の性決定や性分化に関わるか明らかにすることを最終的な目標としている。エクダイソンが性的二型形質の分化促進に関わる例は知られている。たとえば精子の成熟や雄の生殖器原基の分化にはエクダイソンによる刺激が欠かせない。しかし、エクダイソンがどのような分子メカニズムでこのような性分化に加担するのか、全く明らかにされていない。この点を明らかにするためには、エクダイソンの標的因子であり、なおかつ性分化に関わる機能をもつ因子を探索することにした。DMドメインと呼ばれるDNA結合ドメインをもつ転写因子DMRTは多くの動物において雄分化に関与することが知られている。また、昆虫の姉妹群である甲殻類のDMRTであるDMRT93Bは、ミジンコの雄化を誘導する幼若ホルモンの刺激に応じて発現量が増大することが知られている。そこでカイコのdmrt93Bを同定し、TALENによるノックアウトを試みたところ、精巣の萎縮や精子成熟の遅延、雄の内部生殖器の形態的異常を示す個体が得られた。また、dmrt93Bは精巣において特異的に高発現すること、興味深いことにその発現動態はエクダイソン濃度の増減に呼応するかのようなパターンを示すことが明らかになった。そこで精巣におけるdmrt93Bの発現がエクダイソン刺激により増加することを組織培養実験により確認したところ、dmrt93Bの発現量は培地に添加したエクダイソン類縁体（ポナステロンA）の濃度依存的に増加することが判明した。以上の結果から、dmrt93Bがエクダイソン刺激に応じて雄の生殖器官や生殖細胞の性分化に寄与する可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本研究では、エクダイソンの制御下にあり、なおかつ性分化に関わる因子を同定できるかどうかが鍵となっている。そのような因子を同定するため、当初の予定ではRNA-seqによる雌雄で異なる発現を示す遺伝子を網羅的に同定し、なおかつそれらの中からエクダイソンに応答する遺伝子を探索し、さらにRNAiやCRISPR/Cas9による機能解析を行うことで候補遺伝子の絞り込みを行うことを計画していた。しかし、このようなアプローチは目的とする遺伝子に到達する上で時間をようするばかりでなく、必ずしも目的とする遺伝子の同定には至らない可能性がつきまとう。そこで申請者らは、過去の知見を活かしてあらかじめ候補遺伝子を絞り込み、それらの機能をノックアウト実験により明らかにしておこうと考えた。そこで着目した遺伝子が動物界において雄分化に関わる転写因子として広く保存されているDMRTであった。昆虫のDMRTが性分化に関わることを報じた投稿論文は存在せず、我々がカイコゲノムから同定したDMRTオルソログが性分化に関わるか確信がもてなかったが、3つのDMRTのうちDMRT93Bが精巣の発達や精子の成熟、雄の内部生殖器官の分化に必要であることを明らかにすることができた。しかも、その発現量の推移を調べたところ、体液中のエクダイソン濃度に依存するかのような発現パターンを示したことから、エクダイソンに応答することが期待された。そして精巣を用いた組織培養実験により、確かにdmrt93Bがエクダイソンの濃度依存的にその発現量を増加させることを実証することができた。このように、昆虫における知見が存在しない遺伝子の機能を明らかにできただけでなく、その発現がエクダイソンに応答するという２つの大きな発見を成し遂げることができたという点から、当初の計画以上に進展していると評価するに至った。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究成果により、DMRT93BのカイコオルソログBmdmrt93Bがエクダイソン応答性遺伝子であること、また、精巣の発達や精子の成熟、雄の内部生殖器原基の発達に関わる機能をもつことが明らかとなった。そこで本年度は、大きく分けて以下の２点について明らかにする。
１）Bmdmrt93Bはエクダイソンの直接の標的遺伝子か？
Bmdmrt93Bの転写開始部位から3kbまでの上流配列には、エクダイソン応答性のシスエレメントに高い相同性を示す塩基配列が３箇所含まれることが昨年度の研究により明らかにされている。そこでこれらの配列を含むレポーターコンストラクトを構築し、エクダイソン応答性のカイコ培養細胞を用いたレポーターアッセイにより、エクダイソンの応答に責任をもつ領域の絞り込みを行う。エクダイソン受容体に対する抗体を用いたChIP-qPCRを行い、生体内において実際に目的とする領域にエクダイソン受容体が結合しているかどうか検証する。
２）Bmdmrt93Bの下流因子は何か？
Bmdmrt93Bがどのようにして精巣や内部生殖器原基の性分化を制御するのかを明らかにするため、Bmdmrt93Bの下流で働く因子の同定を試みる。これまでの研究により、Bmdmrt93Bは精巣において最も高い発現を示すことが明らかにされている。この点に着目し、野生型とBmdmrt93B変異体の精巣における遺伝子発現プロファイルをRNA-seqにより比較し、差分解析を行うことによりBmdmrt93Bの支配下にある遺伝子を探索する。一方、雄の内部生殖器原基の分化は精巣から分泌されるペプチドにより誘導されるとの知見が存在する。そこで、GC-MSを用いて精巣において生合成されるペプチド成分を野生型とBmdmrt93B変異体間で比較し、Bmdmrt93Bの働きにより合成されるペプチドを特定する。
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| Remarks |
教育啓蒙活動のため、私立星陵高等学校、青森県立五所川原高校、私立安田学園中学校において出前講義を行った。
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