アミド合成工業酵素群の分子機能解析

2017 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 17H03962
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 橋本 義輝 筑波大学, 生命環境系, 准教授 (00323254)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 白木 賢太郎 筑波大学, 数理物質系, 教授 (90334797) ; 小林 達彦 筑波大学, 生命環境系, 教授 (70221976)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 微生物 / 酵素

Outline of Annual Research Achievements

各種アミド化合物の工業生産菌であるPseudomonas chlororaphis B23株とRhodococcus rhodochrous J1株のニトリル合成・分解・分解代謝機構は高い潜在能力を持つと期待される。本研究では、ニトリル分解に関わる酵素・機能性タンパク質・プロモーターの機能を詳細に解明することを目的とする。
各種ニトリル分解に関わる酵素群のなかで、（他の酵素に関しては継続して研究を進めているが）現在、特にB23株ニトリル水和酵素のアクセサリータンパク質に関して得られている成果について以下に記載する。
ニトリル水和酵素構造遺伝子（nhpAB）のみを持つDNA断片、ニトリル水和酵素構造遺伝子およびアクセサリータンパク質と推定される遺伝子（nhpABC）を持つDNA断片をPCRによりそれぞれ増幅後、pET-24a(+)を使用して発現プラスミドを構築した。各々のプラスミドを大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL株に導入（以下、nhpAB発現株およびnhpABC発現株とする）し、硫酸鉄を含む栄養培地で、IPTG添加により誘導発現させ、様々な温度で培養を行った。集菌した後、無細胞抽出液を調製しSDS-PAGEに供した結果、nhpC遺伝子の有無に関わらずニトリル水和酵素のバンドが確認できた。しかし、いずれの条件においてもNhpCのバンドは確認できなかった。ガスクロマトグラフィーによる活性測定を行った結果、nhpABC発現株のみニトリル水和酵素が認められたことから、nhpC遺伝子産物が本酵素の翻訳後の活性発現に何らかの影響を与えることが示唆された。nhpABC発現株では酵素活性を指標に、nhpAB発現株ではSDS-PAGE上でのバンドを指標に精製を行った結果、nhpABC発現株からのニトリル水和酵素の精製には成功したが、nhpAB発現株においてはニトリル水和酵素が非常に不安定であり精製には至っていない。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

ニトリル水和酵素の下流に存在する遺伝子（nhpC）とニトリル水和酵素遺伝子（nhpAB）を同時に大腸菌に導入しないと酵素活性が認められないことから、nhpC遺伝子産物の本酵素へのアクセサリータンパク質としての機能が示唆された。nhpC遺伝子産物のニトリル水和酵素への翻訳後活性化機構を明らかにするために、活性を示すニトリル水和酵素（ホロ酵素）をnhpABC発現株から、また、活性を保持しない酵素（アポ酵素）nhpAB発現株からの精製を行った結果、nhpABC発現株からホロ酵素を精製することに成功した。しかし、nhpAB発現株で発現させたアポ酵素は透析中に凝集するなど非常に不安定であり精製が困難であり、現在、本アポ酵素の安定化条件を検討している。併せて、他の実験も進めており、おおむね順調に進展している。

Strategy for Future Research Activity

nhpAB発現株で発現させた活性を保持しないニトリル水和酵素は非常に不安定である。そのため、安定化条件を検討し、大量培養した後、アポ酵素を精製する予定である。さらには、nhpABC発現株およびnhpAB発現株から精製したそれぞれの酵素について分光学的手法を含む方法を用いて諸性質解明を行うとともに、ニトリル水和酵素の翻訳後成熟化過程おけるアクセサリータンパク質の役割を検討する予定である。
また、J1株Self-Subunit Swapping機構の詳細な解析およびJ1株ニトリル水和酵素の翻訳後修飾機構の解析についても、研究実施計画に基づき研究を行う予定である。