2018 Fiscal Year Annual Research Report
微弱電流によるナノ粒子の腫瘍内浸透・細胞取込み亢進による革新的がん治療技術の確立
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17H03976
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
小暮 健太朗 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 教授 (70262540)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
南川 典昭 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 教授 (40209820)
田中 保 徳島大学, 大学院医歯薬学研究部(薬学域), 准教授 (90258301)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ドラッグデリバリー / 微弱電流 / ナノ粒子 / がん治療 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腫瘍を標的としたナノ粒子は、EPR効果により腫瘍組織までは到達するが、腫瘍内への浸透と細胞取り込みが改善すべき課題である。一方、申請者は独自アプローチにより、微弱電流刺激（イオントフォレシス）が組織・細胞生理を変化させ、外来物質の浸透と細胞取込みを促進することを見出している。この知見に基づき本研究では、がん治療用核酸を封入したナノ粒子を担がんマウスに静脈内投与し、EPR効果により腫瘍に到達したナノ粒子を、腫瘍の微弱電流処理により、組織内に浸透させ、さらに細胞に取り込ませることで、効率的なRNAi効果によるがん治療法を確立することを目的としている。
平成30年度は、イオントフォレシスによって腫瘍内奥へのナノ粒子の浸透性向上の確認に成功した。この検討は、平成29年度に試みていたが、腫瘍成長のバラつきなどが問題であったが、種々条件の最適化により克服することができた。また、発育鶏卵静脈内に投与した蛍光物質が、微弱電流処理によって血管漏出することを見出した。発育鶏卵の血管透過性に関する検討も、平成29年度は低分子蛍光色素のみの検討であったが、分子量10,000および70,000の蛍光標識デキストランについても、微弱電流処理によって血管からの漏出が有意に向上することを見出すことに成功した。さらに、腫瘍組織のイオントフォレシス（微弱電流処理）によって、細胞間隙構成タンパク質であるGap Junction構成タンパク質コネキシンCx43の発現量減少とリン酸化の亢進を確認することに成功している。さらにその過程において、微弱電流処理が細胞レベルでHsp90タンパク質活性化を介してGTPaseを活性化することを見出した。また、iRed封入ナノ粒子の腫瘍内送達および腫瘍遺伝子のノックダウン検証については、現在検討中であり、平成31年度にずれこむが予想の結果を得られると考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成29年度に、腫瘍成長のバラつきによって、当初計画が遅れたため、平成30年度にシグナル伝達系の活性化等の検討がずれ込んだが、概ね計画通りに進行するとともに、平成29年度に新たに加えた発育鶏卵の系においても、概ね計画通りに進行したと考えている。iRed封入ナノ粒子の腫瘍内送達および腫瘍遺伝子のノックダウン検証も現在引き続き検討中であり、若干予定より遅れてはいるが、順調であると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
イオントフォレシス（IP）によるナノ粒子のがん細胞質送達とiRed封入ナノ粒子による腫瘍遺伝子ノックダウンとがん治療効果の検証
i) IPによるナノ粒子のがん細胞質送達：蛍光標識iRed封入ナノ粒子を担がんマウスに尾静脈投与し、腫瘍にIP処理後、一定時間後に回収した腫瘍を細胞レベルに分解したものについて、Flow cytometryにより細胞蛍光量測定からがん細胞のナノ粒子取り込み量を評価する。回収細胞をエンドソーム／リソソームを染色後、共焦点レーザー顕微鏡によりナノ粒子の細胞内動態を観察し、iRedの細胞質送達を評価する。
ii) iRed封入ナノ粒子による腫瘍遺伝子ノックダウン：メラノーマ細胞特異的MITF遺伝子およびがん治療ターゲット遺伝子Ki-67に対するiRedを用いてナノ粒子を調製し、担がんにマウス尾静脈投与後、IP処理を施す。IP処理後に回収した腫瘍中のMITF mRNA発現量を定量評価する。
iii) 治療用核酸封入ナノ粒子送達によるがん治療効果の検証
ナノ粒子投与とIP を行い、30 日間ほど腫瘍成長を経時的に追跡する。異なる投与量や投与間隔による検討を行い、高い抗腫瘍活性を示す条件を最適化する。腫瘍成長経時変化の計測最終日に、腫瘍を回収し、切片についてヘマトキシリン・エオシン染色およびタネル染色を行うことで、腫瘍組織の状態およびアポトーシスの有無を確認する。
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